Методы исследования в цитологии и гистологии таблица — LiveAcademy

Объекты и методы исследования в Гистологии

Методы исследования в цитологии и гистологии таблица — LiveAcademy

Основными Объектами исследования являются гистологические препараты, а главным методом исследования – микроскопирование.

Гистологический препарат должен быть достаточно прозрачным (тонким) и контрастным. Он изготавливается как из живых, так и из мёртвых (фиксированных) структур. Препарат может представлять собой взвесь клеток, мазок, отпечаток, плёнку, тотальный препарат и тонкий срез.

Процесс изготовления гистологических препаратов для микроскопических исследований включает в себя следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация; 2) уплотнение материала; 3) приготовление срезов; 4)окрашивание, или контрастирование срезов; 5) заключение срезов.

Для окрашивания применяются специальные гистологические красители с различным значением рН: кислые, нейтральные и основные. Структуры, окрашивающиеся ими, соответственно, называются оксифильными, нейтрофильными (гетерофильными) и базофильными.

Какими же методами пользуется гистологическая наука? Они довольно многочисленны и разнообразны:

Микроскопирование

Световая микроскопия. Современные микроскопы обладают высокоразрешающей способностью. Разрешающая способность определяется наименьшим расстоянием (d) между двумя рядом расположенными точками, которые можно видеть раздельно. Это расстояние зависит от длины световой волны (λ) и выражается формулой: d = 1/2 λ.

Минимальная длина волны видимой части спектра 0,4 мкм. Следовательно, разрешающая способность светового микроскопа составляет 0,2 мкм, а общее увеличение достигает 2500 раз.

Ультрафиолетовая микроскопия. Длина волны ультрафиолетового света – 0,2 мкм, следовательно, разрешающая способность ультрафиолетового микроскопа 0,1 мкм, но так как ультрафиолетовое излучение является невидимым, то для наблюдения исследуемого объекта необходим люминесцентный экран.

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Коротковолновое (невидимое) излучение, поглощаясь рядом веществ, возбуждает их электроны, которые излучают свет с большей длиной волны, становясь видимой частью спектра. Таким образом, добиваются повышения разрешающей способности микроскопа.

Фазовоконтрастная микроскопия позволяет излучать неокрашенные объекты.

Поляризационная микроскопия применяется для изучения архитектоники гистологических структур, например, коллагенового волокна.

Электронная микроскопия даёт возможности изучать объекты, увеличенные в десятки тысяч раз.

Микрофотосъёмка и микрокиносъёмка. Эти методы позволяют изучать фиксированные объекты на фотографиях и живые микроскопические объекты в движении.

Методы качественных и количественных исследований

Гисто и цитохимия, в том числе количественная, позволяет проводить качественный анализ исследуемых объектов на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях.

Цитоспектрофотометрия Даёт возможность изучать количественное содержание тех или иных биологических веществ в клетках и тканях на основе поглощения света определённой длины волны связанным ими красителем.

Дифференциальное центрифугирование позволяет разделять содержимое клеток, отличающихся между собой своей массой.

Радиография Основана на включении радиоактивной метки (например, радиоактивного йода, Н³-тимидина и др.) в обменный процесс.

Морфометрия позволяет производить измерение площадей и объёмов клеток, их ядер и органелл с помощью окуляр – и объект-микрометров и специальных сеток.

Применение ЭВМ для автоматической обработки цифрового материала.

Метод культуры тканей представляет собой поддержание жизнеспособности и деления клеток и тканей вне организма. Для этого используют специальные контейнеры с питательной средой, в которых создаются все необходимые условия для жизнедеятельности клеток.

С помощью этого метода можно изучать дифференцировку и функциональное становление клеток, закономерности их злокачественного перерождения и развития опухолевого процесса, межклеточное взаимодействие, поражение клеток и тканей вирусами и микроорганизмами, влияние лекарственных препаратов на обменные процессы в клетках и тканях и т. д.

Прижизненное (витальное) окрашивание используется для изучения явлений фагоцитоза и активности макрофагов, фильтрационной способности почечных канальцев и др.

Метод трансплантации тканей. Этот метод применяют с целью изучения поведения клеток и их морфофункционального состояния при их пересадке в другой организм. К примеру, этот метод используется для поддержания жизни животных, подверженных облучению смертельной дозой.

Микроманипуляции. Данный метод получил применение в молекулярной биологии, генной инженерии, а также при клонировании, когда с помощью микроманипулятора удаляют ядро из яйцеклетки с гаплоидным набором хромосом и пересаживают в неё ядро соматической клетки с диплоидным набором хромосом.

Источник: https://veterinarua.ru/gistologiya/19-ob-ekty-i-metody-issledovaniya-v-gistologii.html

Цитологическое исследование: этапы и достоинства цитологического метода в онкологии и гинекологии

Методы исследования в цитологии и гистологии таблица — LiveAcademy

Цитологическое исследование — одно из самых востребованных в онкологии. С его помощью врач оценивает состояние клеточных элементов и делает заключение о  злокачественной или доброкачественной природе новообразования. Изучаются особенности строения клеток, клеточный состав органов, тканей, жидкостей организма человека.

Цитологическое исследование применяется при диагностике предраковых заболеваний и злокачественных новообразований различных органов: шейки и тела матки, молочной железы, щитовидной железы, легких, кожи, мягких тканей и костей, желудочно-кишечного тракта, лимфатических узлов и др.

Для цитологического исследования берут мазки свода влагалища и шейки матки, мокроту, мочу, экссудаты из полостей и т.д.

Когда назначается цитологическое исследование?

В большинстве случаев врачи – терапевты, гинекологи, онкологи и другие специалисты — прибегают к цитологической диагностике при подозрении на опухолевое заболевание.

Цитологический метод применяется для исследования новообразований в различных органах – кожа, молочная железа, лёгкие, средостение, печень, почки, забрюшинные образования, щитовидная железа, предстательная железа, яичко, яичники, лимфатические узлы, миндалины, слюнные железы, мягкие ткани, кости и др.

Наибольшее распространение цитологические исследования получили в области гинекологии. Это доступный и быстрый метод скрининга, доказавший свою эффективность в диагностике предраковых заболеваний и раннего рака шейка матки.

Нередки случаи, когда цитологическое исследование помогало обнаружить рак желудка, легкого, мочевого пузыря и др. на самых ранних стадиях, когда рентгенологические и эндоскопические исследования не выявили изменений.

В период лечения опухолевого заболевания необходимо постоянно контролировать эффективность проводимой терапии. Для этого необходимы быстрые и эффективные методы диагностики.

Цитологическое исследование в этих случаях позволяет оперативно получить ответы на большинство возникающих у врачей вопросов по поводу течения болезни.

Цитологическое исследование широко используется также и после окончания специализированного (хирургического, химиотерапевтического или лучевого) лечения для контроля течения заболевания и раннего выявления возможного рецидива или прогрессирования опухоли (исследование лимфатических узлов, плеврального экссудата и т.д.).

Основные области применения цитологических исследований в онкологии:

  • Скрининг, профилактические осмотры
  • Диагностика – установление и уточнение диагноза
  • Контроль результатов во время и после проведения терапии

В чем отличие цитологии от гистологического исследования?

Отличие цитологического исследования от гистологического, в первую очередь, заключается в том, что изучаются именно клетки, а не срезы тканей.

Для гистологического исследования требуется либо операционный материал, либо забор материала методом трепан-биопсии.

Для цитологического же исследования достаточно мазка со слизистой оболочки, соскоба с поверхности опухоли или материала, полученного тонкой иглой.

Подготовка гистологического препарата требует больше усилий и времени, нежели подготовка для цитологического анализа.

Как выполняется цитологическое исследование?

Для анализа используют различный биоматериал.

Эксфолиативный материал, то есть полученный методом «слущивания»:

  • соскобы с поверхности эрозий, ран, язв;
  • соскобы с шейки матки и цервикального канала, аспираты из полости матки;
  • секреты желез, экскреты, мокрота, транссудаты, экссудаты, промывные воды и т.д.
  • Исследование мочи на атипические клетки

Пункционный материал:

  • пунктаты, полученные тонкой иглой (тонкоигольная биопсия)
  • отпечатки материала трепан-биопсий  из опухолей и различных новообразований

Операционный материал:

  • мазки-отпечатки и соскобы с удаленной ткани, жидкость, смывы и др. материал, полученный при проведении хирургических вмешательств.

Эндоскопический материал:

  • материал, полученный при проведении эндоскопического исследования

Цитологическое исследование — наиболее щадящий метод диагностики. Обычно забор материала для анализа протекает безболезненно, в амбулаторных условиях, без травматического воздействия на органы и ткани.

Взятый для анализа клеточный материал в цитологической лаборатории переносят на предметные стекла, окрашивают и исследуют под микроскопом.

Цитоморфолог использует в своей работе совокупность признаков атипии клетки, критически оценивая их наличие и степень выраженности. Результат анализа напрямую зависит от профессионализма специалиста, проводящего исследование: как в части подготовки материала, так и в части его исследования под микроскопом.

На поверхности опухолевых клеток есть особые белки – антигены. Причем, каждая опухоль экспрессирует свой собственный набор антигенов.

При необходимости с помощью специальных реактивов для иммуноцитохимического исследования врач-цитолог может не только установить наличие злокачественно трансформированных клеток в исследуемом образце, но и определить гистотип опухоли, ее органную принадлежность, факторы прогноза и чувствительность к лечению.

  • абсолютная безвредность для пациента
  • безболезненность
  • возможность применения многократных цитологических исследований
  • быстрота
  • диагностика злокачественных опухолей любой локализации и в любой стадии процесса.

Обычно для проведения исследования требуется несколько часов. Интраоперационное цитологическое исследование может быть выполнено в течение 10 минут.

За счет его безвредности, цитологический метод незаменим для оценки динамики морфологических изменений в клетках опухоли во время лечения, для определения терапевтического эффекта проводимого лечения. Для таких пациентов он имеет несомненные преимущества перед другими, более инвазивными методами исследования.

Методы цитологических исследований постоянно совершенствуются. Развитие эндоскопической техники позволяет целенаправленно получать материал для исследования из внутренних органов, ранее недоступных для морфологического анализа без оперативного вмешательства.

Таким образом, цитологическое исследование, благодаря сочетанию высокой информативности, безвредности для пациента и скорости проведения, при отсутствии травматизации тканей, имеет огромное значение в онкологии.

Источник: https://nii-onco.ru/diagnostika/citologicheskoe-issledovanie/

19.Возникновение и развитие гистологии и цитологии как самостоятельных наук. Методы исследования в гистологии, цитологии и эмбриологии

Методы исследования в цитологии и гистологии таблица — LiveAcademy

Гистология– раздел биологии, изучающий строениетканей живых организмов. В отличие отанатомии, гистология изучает строениеорганизма на тканевом уровне. Гистологиязародилась задолго до изобретениямикроскопа.Первые описания тканей встречаются вработах Аристотеля,Галена, Авиценны, Везалия.

В 1665 году Р.Гук ввёлпонятие клеткии наблюдал в микроскоп клеточное строениенекоторых тканей. Гистология как наукаи как дисциплина объединяют в 2 раздела: общую ичастную гистологию.Гистологические исследованияпроводили М. Мальпиги,А. Левенгук,Я. Сваммердам, Н. Грю и др.

Новый этапразвития науки связан с именами К. Вольфаи К. Бэра — основоположников эмбриологии.В середине XIX векаА. Кёлликер,Лейдинг идр. создали основы современного ученияо тканях.К.Майер ввелтермин “гистология” в изданном в1819 г. труде “О гистологии и новомподразделении тканей человеческоготела”.

Общаяизучает основные, фундаментальнысвойства важнейших групп тканей, ачастная изучает особенностиструктурно-функциональной организациии взаимодействия тканей в составеконкретных органов. Таким образомглавным источником изучения общей ичастной гистологии являются – ткани.

Цитология–это раздел биологии, который изучаетживые клетки, их строение, процессыразмножения, функционирования, старенияи смерти.

Впервыеупотребил термин «клетка»Роберт Гукв 1665году. Так уже в 1838 – 1839 годах анатомТеодор Шванни ботаник Матиас Шлейден, почтиодновременно, выдвинули теорию клеточногостроения организма.

Клеточнаятеория доказывает, что все животныеи растения состоят из сходных клеток,а каждая клетка обладает всеми свойствамиживого. Цитологию как и гистологию подразделяютна общую ичастную.Общаяизучает общиеструктурно-функциональные свойстваприсущие всем клеткам организма.

Частнаярассматривает специфическиехарактеристики клеток конкретных тканейи органов.

  1. Методы микроскопирования гистологических препаратов

Основнымиметодами изучения биологическихмикрообъектов

являютсясветовая и электронная микроскопия,которые широко используются в

экспериментальнойи клинической практике.

  1. Методы исследования фиксированных клеток и ткане.

Основнымобъектом исследования являютсягистологические препараты, приготовленныеиз фиксированныхструктур.

  1. Методы исследования живых клеток и тканей

Изучениеживых клеток и тканей позволяет получитьнаиболее полную информацию об ихжизнедеятельности— проследить движение, процессы деления,разрушения, роста, дифференцировки ивзаимодействия клеток, продолжительностьих жизненного цикла, реактивные измененияв ответ на действие различных факторов.

  1. Методы исследования химического состава и метаболизма клеток и тканей

  2. Количественные методы

Особенностьколичественно-гистохимических (в отличиеот биохимических) методов

https://www.youtube.com/watch?v=NIRCkWaysjE

исследованиязаключается в возможности изученияконцентрациии содержанияхимических компонентов в конкретныхструктурах клеток и тканей.

20.Развитие гистологии, цитологии и эмбриологии в России. Основные заслуги а.И. Бабухина, к.Э. Бэра, к.А. Арнштейна, н.А. Хржонщевского

ВРоссии первыесамостоятельные кафедрыгистологии и эмбриологиибыли учреждены в60-х годах 19века в Медико-хирургической(ныне Военно-медицинской) академии,Московском и Петербургском университетах.Несколько позже они были основаны вКазанском, Киевском и Харьковскомуниверситетах.

Первыми профессорами —руководителями кафедр гистологии былиН.М. Якубович,А.И. Бабухин,Ф.В. Овсянников,А.С. Голубев,П.И. Перемежко, НА. Хржонщевский. Споявлением кафедр начали формироватьсяи первые гистологические научные школы— Петербургская,Московская, Харьковскаяи др.

Петербургская(ленинградская) школа гистологовформировалась в стенах Медико-хирургическойакадемии,так как здесь в числе одной из первых вРоссии была основана кафедра гистологии.Впервые в России систематическоепреподавание гистологии и эмбриологиибыло введено в академии К.

М. Бэром,руководившим кафедрой сравнительнойанатомии и физиологиив 1841-1852 гг. Первым профессором,специализировавшимся в областигистологии, был Н.М. Якубович(1817-1879), он и возглавил образовавшуюсясамостоятельную кафедру гистологииМедико-хирургической академии (в 1868г.).

1869года — ординарный профессор, заведующийпервой в России кафедры гистологии,эмбриологии и сравнительной анатомии.Исследования А. И. Бабухинаоказали большое влияние на развитиегистологии и физиологии нервно-мышечнойсистемы.

КарлА́вгустович Арнште́йн(1840—1919) — российский учёный, профессоргистологии Казанского университета,один из основателей Казанской школынейрогистологов. основалказанскую школу нейрогистологов.

Основные труды Арнштейна и его учениковпосвящены гистологии нервной системы,в том числе по изучениюпериферических нервных окончаний.ОснователемКазанской школы К. А.

Арнштейном(1840-1919) и его учениками собран богатейшийматериал по морфологии нервных волокони нервных узлов в различных тканях иорганах (в мочевом пузыре, мочеточнике,половых органах, роговице, легком,пищеводе, коже и др.).

В1866 году Хржонщевскийосновал гистологическую лабораторию,которая за период с 1866 по 1869 годопубликовала 18 научно-исследовательскихтрудов в лучших немецких научныхжурналах. НиканорХржонщевскийвнёс значительный вклад в гистологию,гистофизиологию,патологическую физиологию.

Ему принадлежатнесколько десятков научных работ, в томчисле в ведущих заграничных научныхжурналах.Хржонщевскийпредложил вводить живому подопытномуживотному витальный (не приводящий кгибели) краситель и наблюдать егодвижение по кровеносным и лимфатическимсосудам, а также его выделение полымипротоками секреторных и выделительныхорганов[26].

При помощи этого методаХржонщевскому удалось детальноисследовать капилляры, лимфатическиесосуды, жёлчные протоки, строениенефрона.

Источник: https://studfile.net/preview/6863508/page:6/

Методы цитологии

Методы исследования в цитологии и гистологии таблица — LiveAcademy

Строение, ультраструктура и функционирование клеточных органоидов исследуется в настоящее время с помощью следующих основных методов: световой и электронной, темнопольной, фазово-контрастной, поляризационной, люминесцентной микроскопии, используемых для изучения строения, ультраструктуры фиксированных клеток, и дифференциального центрифугирования, позволяющего выделять отдельные органоиды и анализировать их цитохимическими, биохимическими, биофизическими, и другими методами.

Световая микроскопия.

Принцип метода состоит в том, что пучок света, пройдя через объект, попадает в систему линз объектива, и строит первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, – объектив.

В современных микроскопах объективы сменные, что позволяют изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность, т.е. способность давать раздельное изображение двух близких друг к другу объектов.

Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например проекции на экран (до 105 раз). Разрешающая способность светового микроскопа ограничивается длиной волны света: чем меньше длина волны, тем выше разрешающая способность.

Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать фиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130 – 140 нм (0,13-0,14 мкм).

Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света.

Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, – это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую способность около 0,1 мм, что равно 100 мкм).

Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей.

Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа.

Электронная микроскопия.

В принципе электронный микроскоп устроен так же, как и световой, только роль светового пучка выполняет в нем пучок электронов, а фокусируется этот пучок не линзами, а электромагнитами.

Однако для пучка электронов длина волны значительно короче длин волн видимого света, что и обеспечивает более высокую разрешающую способность электронного микроскопа по сравнению со световым микроскопом.

Разрешение у современных электронных микроскопов 0,2-1 нм.

В трансмиссионном электронном микроскопе электроны проходят сквозь объект подобно тому, как в световом микроскопе сквозь него проходит свет. В результате пучок электронов создает изображение объекта на фотографической пластинке.

Одно из главных неудобств электронного микроскопа заключается в том, что в камере должен поддерживаться высокий вакуум, потому что в воздушной среде электроны легко отклоняются и захватываются молекулами газа.

Живая же материя не может существовать в высоком вакууме, так как в этих условиях испаряется вся содержащаяся в ней вода; поэтому при помощи трансмиссионного электронного микроскопа можно исследовать только фиксированный материал.

Кроме того, срезы должны быть очень тонкими, чтобы сквозь них могли проходить электроны.

В сканирующем электронном микроскопе электроны отражаются от поверхности объекта и создают изображение при движении в обратном направлении.

Предел разрешения у сканирующего микроскопа ниже, чем у трансмиссионного, и ему требуется не столь высокий вакуум.

Благодаря этому с помощью сканирующего электронного микроскопа можно проводить прижизненные исследования некоторых организмов с достаточно твердыми покровами.

Он позволяет также получать превосходные фотографии, воспроизводящие в мельчайших деталях поверхности некоторых живых существ. Чтобы усилить контрастность конечного изображения, почти все объекты окрашивают.

В световой микроскопии используют красители, а для трансмиссионного электронного микроскопа – фиксаторы, содержащие тяжелые металлы (например, четырехокись осмия, перманганат калия, свинец), способные поглощать электроны.

Для сканирующего электронного микроскопа материал часто замораживают, чтобы получить поверхность, покрытую льдом. При этом исключаются потери воды водорастворимых веществ, меньшими являются также химические изменения структур.

При анализе данных, полученных с помощью электронного микроскопа, надо помнить, что этим методом исследуются статические состояния клетки в момент быстрой остановки движения цитоплазмы, вызванной воздействием фиксирующих химических веществ.

Темнопольная микроскопия

Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света (эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.

Метод фазово-контрастной микроскопии основан на том, что отдельные участки прозрачной, в общем, клетки хоть мало, но все же отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как он чувствителен только к изменению интенсивности света.

В фазово-контрастном микроскопе в объектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.

С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающие так называемой изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (волокна веретена деления, миофибриллы и др.). У такого микроскопа перед конденсором помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной скоростью поляризации.

После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой плоскостью поляризации. Когда между скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е.

способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.

При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующие красители и метод флуоресцентной микроскопии.

Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладают способностью светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии.

Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Этот принцип позволяет рассматривать флуоресцирующие объекты в зоне коротких волн.

В таких микроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области. Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы.

Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы, бактериальные пигменты), витамины (А и В2), гормоны.

Можно применять метод флуоресцентной микроскопии, добавляя живым клеткам флуоресцирующие вещества, которые избирательно связываются с определенными структурами, вызывая их вторичную люминесценцию.

Для изучения клеток органов и тканей животных используют метод клеточных культур. Простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную питательной средой, помещают небольшой кусочек живой ткани. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток.

В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина или хелатона версена, что приводит к его диссоциации, к полному разобщению клеток друг от друга.

Затем такую взвесь отмытых клеток помещают в сосуд с питательной средой, где они опускаются на дно, прикрепляются к стеклу и начинаются размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт.

Так растут однослойные клеточные культуры, очень удобные для прижизненных наблюдений. При культивировании вне организма кроме смены среды важно поддерживать и необходимую температуру, и соблюдение стерильности. В культуре можно выращивать и растительные клетки.

Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду, где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток.

Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и генетических, вирусологических и биохимических исследований.

Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонадсадок к микроскопу. Живую клетку можно снимать и на кинопленку.

Применяя такую ускоренную или замедленную киносъемку (цейтраферная съемка), можно подробно видеть протекание важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, биение ресничек и т.д.

Несмотря на важность и достаточную простоту витальных наблюдений, большая часть сведений о структуре и свойствах клеток получена на фиксированном материале.

Задачи фиксации – это убить клетку, прекратить активность внутриклеточных ферментов, предотвратить распад клеточных компонентов, а также избежать потери структур и веществ, препятствовать появлению структур, отсутствующих в живой клетке.

В качестве фиксаторов применяют альдегиды и их смеси с другими веществами, спирты, сулема, четырехокись осмия и др. После фиксации объекты подвергают дополнительной обработке – окрашиванию. Для окраски применяют различные натуральные (гематоксилин и кармин и др.) и главным образом синтетические красители.

Но для окрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Срезы до 5 -10 мкм получают на микротоме.

Существует ряд специфических красочных приемов направленных на выявление специфических химических веществ получил название гистохимических или цитохимических. Это собственно цитохимические реакции.

Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность, связывание красителя, неизменность, локализация вещества.

Количество конечного продукта цитохимической реакции можно определить с помощью цитофотометрии.

Основу его составляет определение количества химических веществ по поглощению ими света определенной длины волны (например, при определении количества ДНК на клетку после реакции Фельгена).

Количественную оценку получают не только поглощающие объекты и вещества, но и излучающие.

Разработаны приемы количественной флуорометрии, позволяющие по степени свечения определить содержание веществ, с которыми связываются флуорохромы.

Для выявления белков, отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или для определения мест локализации РНК-ДНК – гибридных молекул используют метод иммунофлуоресценции.

Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отдельных клеток широко используют метод авторадиографии – регистрации веществ, меченых изотопами. Например, с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.

В цитологии применяют различные аналитические и препаративные методы биохимии. В последнем случае можно получить в виде отдельных фракций разнообразные клеточные компоненты и изучать их химию, ультраструктуру и свойства. В настоящее время в виде чистых фракций получают практически любые клеточные органеллы и структуры.

Одним из основных способов выделения клеточных структур является дифференциальное (разделительное) центрифугирование.

Принцип его применения состоит в том, что время для оседания частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки.

Чтобы ускорить этот процесс оседания используют ускорения, создаваемые центрифугой.

При повторном дробном центрифугировании смешанных подфракции можно получить чистые фракции.

В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе.

Полученные фракции, прежде чем их анализировать биохимическими способами, необходимо проверить на чистоту с помощью электронного микроскопа.

Контрольные вопросы:

1. Уровни организации живой материи

2. Клеточная теория организации организмов

3. Методы исследования в цитологии

4. Задачи и предмет цитологии

5. Устройство светового микроскопа

6. Устройство электронного микроскопа

7. Техника безопасности при цитологических работах

8. Требования к подготовке биологического материала для цитологического исследования

9. Фиксирующие вещества, механизм действия

10. Цитохимия, требования к материалу и возможности

11. Количественный анализ (морфометрия), требования и возможности

12. Артефакты в цитологии, пути объективизации результатов

Рекомендуемая литература:

1. Заварзин А.А., Харазова А.Д. Основы общей цитологии. – Л., 1982.

2. Ченцов Ю.С. Основы цитологии. – М., 1984.

3. Шубникова Е.А. Функциональная морфология тканей. – М., Изд-во МГУ, 1981.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: https://studopedia.ru/12_57263_metodi-tsitologii.html

Консультация доктора
Добавить комментарий