Методы в современной цитологии

Предмет, задачи, и методы исследования современной цитологии, значение цитологических исследований для других биологических наук, медицины, сельского хозяйства

Методы в современной цитологии

I. Орг.

момент

I нт.

II. Зна II.Проверка д/з:

Ш. Введение в тему

IV. Изучение н/м:

V. Закрепление

VI. Подведение итогов:

VII. Д/З:

VIII.Рефлексия.

Приветствие. Психологический настрой на активную деятельность на уроке.

Организационный момент

Цель этапа:Активизация учащихся, создание ситуации успеха.

Мотивация учащихся к учебной деятельности

А). Работа с тетрадью с заданиями для индивидуальной работы учащегося под редакцией Ж.Курмангалиевой для 10 класса по заданиям – 3 человека:

1).стр. 3 задание 1

2) стр. 3 задание 2

3) стр. 3 задание 3

Б). Устно:

1. Как вы думаете, какова роль биологии в современном обществе, какова роль биологических знаний в нашей жизни?

2. Согласны ли вы с утверждением, что биология – ведущая наука 21 века? Какие крупные открытия сделаны в последние годы?

3. Для решения, каких глобальных задач человечества необходимы знания биологии?

4. Приведите примеры использования методов биологических наук из ботаники, зоологии, анатомии и физиологии человека.

5. Какова основная цель науки?

6. Что такое научный метод? В чем его основной принцип?

7. Что такое научный эксперимент?

8. Каких ученых Казахстана вы запомнили ?

В). Проверка выполнения творческого задания по группам на выбор:

1. Каково значение биологии для понимания всего живого.

2. Напишите эссе «Является ли биологическая наука частью культуры человечества?»

Клетка – это интересный, удивительный и загадочный мир, который характерен для любого живого существа, исключая вирусы. Но разгадать тайны клетки смогли разгадать лишь при изобретении в конце 16 века первого микроскопа.

Используя слайд 3, скажите: что объединяет растительную и животную клетки?

(ядро, мембрана, цитоплазма).

А). Предмет и задачи цитологии (слайд 4).

На рубеже19 и 20 веков сформировалась новая биологическая наука ЦИТОЛОГИЯ (от греческого «cytos» – ячейка, клетка, «logos» – учение) – наука, изучающая строение клетки, её химический состав и процессы жизнедеятельности, происходящие в ней.

Предметом ее изучения является клетка как структурная и функциональная единица жизни.

В задачи цитологии входит изучение

  • строения и функционирования клеток,
  • их химического состава,
  • функций отдельных клеточных компонентов,
  • познание процессов воспроизведения клеток,
  • приспособления к условиям окружающей среды,
  • исследование особенностей строения специализированных клеток,
  • этапов становления их особых функций,
  • развития специфических клеточных структур и др

Б).Методы изучения клетки их значение для других биологических наук, медицины, сельскохозяйственного производства (слайды 5- 7).

Для решения перечисленных задач в цитологии используются различные методы исследования:

1). Световая микроскопия – основной метод изучения клеток (слайд 5).

2). Электронный микроскоп (слайд 5).3). Гистохимические методы (слайд 6)

4). Метод дифференциального центрифугирования (слайд 6).

5). Метод рентгеноструктурного анализа (слайд 6).

6). Метод авторадиографии (слайд 7).

7). Флуорисцентная микроскопия (слайд 7).

8). Метод культуры клеток и тканей (слайд 8).

9). Методы микрохирургии (слайд 8).

Работа в группах по заданию:

Используя приложение 1, заполните таблицу «Методы изучения клетки»:

В). Значение методов изучения клеток для других биологических наук, медицины, сельскохозяйственного производства.

За последние 40-45 лет цитология из описательно-морфологической превратилась в экспериментальную науку, ставящую перед собой задачи изучения физиологии клетки, ее основных жизненных функций и свойств, ее  биологии. Другими словами – это физиология клетки.

Возможность такого переключения интересов исследователей возникла в связи с тем, что цитология тесно сопряжена с научными и методическими достижениями биохимии, биофизики, молекулярной биологии и генетики.

Вообще, цитология тесно связана практически со всеми биологическими дисциплинами, так как все живое на Земле (почти все!) имеет клеточное строение, а цитология как раз и занимается изучением клеток во всем их многообразии.

Цитология тесно связана с зоологией и ботаникой, поскольку изучает особенности строения растительных и животных клеток; с эмбриологией при изучении строения половых клеток; с гистологией – строение клеток отдельных тканей; с анатомией и физиологией, так как на основе цитологических знаний изучается строение тех или иных органов и их функционирование.

Клетка имеет богатый химический состав, в ней протекают сложные биохимические процессы – фотосинтез, биосинтез белка, дыхание, а также происходят важные физические явления, в частности, возникновение возбуждения, нервного импульса, поэтому цитология тесно связана с биохимией и биофизикой.

Чтобы понять сложные механизмы наследственности, нужно изучить и понять их материальные носители – гены, ДНК, которые являются составными компонентами клеточных структур. Из этого возникает тесная связь цитологии с генетикой и молекулярной биологией.

Данные цитологических исследований широко используются в медицине (общий анализ крови, где по количеству клеток врачи судят о состоянии пациента, искусственное оплодотворение, пластическая хирургия, пересадка клеток красного костного мозга, влияние никотина, алкоголя, наркотиков на клетки организма человека, вызывая в них изменения), сельском хозяйстве (искусственное оплодотворение), ветеринарии, клонировании (генная инженерия), генетике (стволовые клетки, изменение формы эритроцита), в различных отраслях промышленности (пищевая, фармацевтическая, парфюмерная и др.).

Устно:

1). Что изучает цитология?

2). Перечислите известные вам методы исследования клетки.

Какое значение имеет цитология для других наук?

1)    Что такое цитология?2)    Какие задачи существуют в этой науке?

3)    Как человечество решает эти задачи и какие использует для этого методы?

4)    Кем, когда и как была открыта клетка?

5)    Что изучает клеточная биология и какое значение имеет клеточная теория для науки?

6)    Назовите основной метод в цитологии. Насколько важны результаты этого метода в изучении клетки и ее органелл?
7)    Какой вы знаете последний и самый новый метод в цитологии?

Чаще всего используются микроскопические методы исследования, позволяющие изучать структуры клеток и их компонентов. Разные виды микроскопов (световые, люминесцентные, фазово- контрастные) позволяют получать увеличение до 2-2,5 тыс. раз.

С помощью гистохимических методов можно устанавливать локализацию различных химических компонентов (белков, ДНК, РНК, липидов и др.) в клетках. Для изучения тончайших структур клеток (вплоть до макромолекул) применяют метод электронной микроскопии, в котором вместо пучка света используется поток электронов.

Разрешающая способность электронного микроскопа составляет сотни тысяч раз. Биохимические методы исследования позволяют изучать химический состав клеток и биохимические реакции, которые протекают в них. Методом дифференциального центрифугирования выделяют отдельные компоненты клетки (митохондрии, лизосомы т.п.

) для дальнейшего изучения. С помощью метода рентгеноструктурного анализа исследуют пространственную конфигурацию и некоторые физические свойства макромолекул (например, ДНК), что входят в состав клеточных структур.

Процессы матричного синтеза и деления клеток удается изучить с помощью метода авторадиографии – введение в клетку радиоактивных изотопов и последующее изучение их включения в вещества, которые синтезируются клеткой.

Параграф 1 страница 6- 10, конспект, используя словесную формулу Цицерона: Кто? Что? Где? Чем? Зачем? Как? Когда? Составьте вопросы к параграфу.

-Закончите предложение:

«Знания, полученные на уроке мне необходимы…»

«Я получил полезную информацию о том, что…»

Д

Источник: https://infourok.ru/predmet-zadachi-i-metodi-issledovaniya-sovremennoy-citologii-znachenie-citologicheskih-issledovaniy-dlya-drugih-biologicheskih-n-2620329.html

Методы в современной цитологии

Методы в современной цитологии

Современные методы

исследования

Галилео-Галилей (1564-1642)

(итальянский философ, математик, физик

и астроном, оказавший значительное

влияние на науку своего времени;


изобретатель микроскопа)

Один из первых

микроскопов

(1876)

Микроскоп Левенгука


Микроскоп Гука

Микроскоп

как предмет роскоши

С середины ХХ века цитологи получили возможность исследовать не

только целые клетки, но и отдельные органоиды, выделенные из клеток в

жизнеспособном состоянии.

Для этого используется метод фракционирования клеток, основанный на

дифференциальном центрифугировании.

Центрифуга

Разные органоиды осаждаются на дно

пробирки при разных скоростях

центрифугирования.

Скорость оседания зависит от размера

частицы и ее плотности.

При низких скоростях

центрифугирования в первую очередь


осаждаются ядра. Получив осадок ядер,

оставшуюся суспензию переливают в

другую пробирку для следующего этапа

центрифугирования. Осадок, состоящий

из клеточных ядер, размешивают и

используют в экспериментальной работе.


Так повторяют несколько раз, увеличивая

скорость и продолжительность

центрифугирования. Самые высокие

скорости центрифугирования

необходимы для получения самых

маленьких органелл – рибосом.

Метод фракционирования

С помощью этого метода впервые в


клетках были открыты лизосомы –

небольшие вакуоли, содержащие

гидролитические ферменты и

выполняющие пищеварительные

функции в клетках. После открытия

лизосом методом фракционирования, их

обнаружили на срезах клеток под


световым и электронным микроскопом с

помощью метода цитохимии, выявив

работу специфических ферментов.

Возможность получения чистых фракций

отдельных органоидов позволила изучить их

химический состав, набор ферментов и, в

конечном итоге, понять, как работает та или


иная клеточная структура.

Метод авторадиографии

Метод авторадиографии используют для выяснения, в

каких местах в клетке идет синтез тех или иных полимерных

молекул, для изучения, куда переносятся синтезированные

вещества.

Иначе метод называют радиоавтографией.

Этот метод может использоваться применительно и к


световой, и к электронной микроскопии.

Метод позволяет обнаруживать в клетке биологические

полимерные молекулы, меченые радиоактивными

изотопами.

Ядра радиоактивных изотопов нестабильны, подвергаются

распаду, испуская заряженные частицы или γ-лучи.

Экспериментатор регистрирует этот радиоактивный распад

на фотопленке.

5. Современный световой микроскоп

1665 г – монография «Микрография»,


где описаны его микроскопические и

телескопические наблюдения

Роберт Гук

(1635-1703)

КЛЕТКА КАК ЧУДО ИНЖЕНЕРИИ ПРИРОДЫ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ШКАЛА РАЗРЕШАЮЩЕЙ

СПОСОБНОСТИ НЕВООРУЖЕННОГО ГЛАЗА, СВЕТОВОГО

И ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПОВ

УСТРОЙСТВО И ПРИНЦИП РАБОТЫ МИКРОСКОПА


1. Механическая часть

1.1. Корпус

1.2. Механический

(предметный) столик

1.3. Бинокулярная насадка

1.4. Фокусировочный

механизм

2. Осветительная система

2.1. Источник света


2.2. Коллектор

2.3. Конденсор

3. Оптическая часть

3.1. Объективы

3.2. Окуляры

Современный световой микроскоп

Осветительная система светового

Ход лучей в стандартном микроскопе

источник


света

образец

окуляр

объектив

глаз

конденсор

Ход лучей в современном микроскопе

коллектор


источник

света

конденсор

образец

окуля

объектив

изображение


образца

РАЗРЕШЕНИЕ МИКРОСКОПА

Разрешение микроскопа по полю – минимальное расстояние между двумя точками

формируемого им изображения, пока они еще видны раздельно.

света,

2 n sin / 2

l – длина волны используемого

n – показатель преломления среды,


– угол раскрытия объектива.

коллектор

источник

света

конденсор

объектив окуля

изображение

образца


образец

d 0,61

NA – численная апертура объектива, равная n sin( /2).

Разрешение микроскопа по глубине – глубина фокуса.

4 n 1 1

МИКРОСКОП КАК ДИФРАКЦИОННЫЙ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЬ

Дифракция лазерного луча с длиной волны 650 нм,

прошедшего через отверстие диаметром 0,2 мм

F (u )


f ( x )[cos( 2 xu) i sin( 2 xu)]dx

Прямое преобразование Фурье

f ( x)

F (u )[cos( 2 xu) i sin( 2 xu)]du

Обратное преобразование Фурье

Закон масштаба, который гласит, что чем меньше размеры объекта, тем больше


размеры его диффракционной картины

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ

метод светлого поля в проходящем свете

метод косого поля

метод светлого поля в отраженном свете

2) Метод темного поля

3) Метод фазового контраста

4) Метод поляризационной микроскопии

5) Метод интерференционной микроскопии


6) Метод флуоресцентной микроскопии

7) Метод люминисцентной микроскопии

Метод электронной микроскопии

сканирующая электронная микроскопия

Методы современной цитологии

Цитохимия

Методы основанные на


использовании

специфических красителей

(судан черный)

Проведение химической реакции на

срезе на предметном стекле (реакция


Фельгена на выявление ДНК)

17. Методы современной цитологии Иммуноцитохимия

С помощью цитохимических цветных реакций в клетках выявляют

полисахариды,

специфические аминокислоты в белках,

нуклеиновые кислоты,

жиры,


липиды

и множество ферментов, участвующих в метаболических

процессах обмена и превращения веществ.

Ферменты обычно выявляют по наличию продуктов их активности.

Новое направление цитохимии –

иммуноцитохимия,


в настоящее время является

одним из самых передовых

методов клеточной биологии.

Для этого метода используются

люминисцентные микроскопы.

Разрешение таких микроскопов

соответствует световым.

Их особенность в том, что


препарат освещается снизу не

пучком видимого света, а

ультрафиолетовым лучом

определенной длины волны.

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИИ


Устройство

флуоресцентного микроскопа

Упрощенная схема хода

лучей во флуоресцентном

микроскопе


Возможности технологии флуоресцентной микроскопии и не только

Иммуноцитохимия

Другая особенность метода в том, что

используются не обычные,

а люминисцентные, или флюоресцентные

красители для окрашивания препаратов.

Такие красители под воздействием

ультрафиолета дают яркое свечение.

Исследователь видит препарат на темном фоне,


где ярко светятся окрашенные участки клеток.

Культура стромальных стволовых клеток человека.

Зеленым флюоресцирует цитоплазма, содержащая

нестин, синим — ядерный материал.

красным цветом флуоресцирует ДНК клеток, зеленым – клеточная

стенка и цитоплазма с содержащимися в ней пластидами.

С помощью метода иммуноцитохимии изучили

состав и расположение элементов цитоскелета клеток

растений и животных,

какие особенности цитоскелета характерны для опухолевых

клеток.


С помощью этого метода научились выявлять

индивидуальность хромосом человека,

что необходимо при изучении развития патологий, а так же в

судебной медицине.

Метод иммуноцитохимии


позволил выявить на поверхности

разнообразных клеток свои

индивидуальные маркеры, что

облегчило понимание многих

патологических процессов,

позволило выяснить, какие

клеточные типы являются


отправной точкой в развитии ряда

болезней.

Например, показана роль

макрофагов и гладкомышечных

клеток кровеносных сосудов в

развитии атеросклероза.

32. Метод авторадиографии

Авторадиограмма,


показывающая распределение

фосфора в листьях томата

Включение в ядра

соединительнотканных клеток

меченного тритием тимина

(Н3-Т)

Именно методом авторадиографии было показано,

ДНК всегда находится в ядре и никуда оттуда не


выходит.

РНК, напротив, синтезируется в ядре, а затем

выходит в цитоплазму.

Белок никогда не синтезируется в ядре.

Место синтеза белка – рибосомы цитоплазмы.

Отсюда белок может перемещаться и в ядро, и

внутрь органелл цитоплазмы.

Метод клеточных культур

Для получения клеточной культуры небольшие кусочки ткани

диссоциируют на отдельные клетки, используя ферментативную и

механическую обработку, и получают суспензию клеток.

стеклянные или пластиковые, и заливают искусственной питательной

средой.


Для каждого типа клеток среда индивидуальна.

Для большинства животных клеток питательная среда имеет в своем

составе глюкозу, незаменимые аминокислоты, витамины и небольшой

процент сыворотки крови.

Важно поддерживать нейтральную реакцию среды, оптимальную

температуру, не допускать инфекционного заражения.

Именно с помощью метода клеточных культур впервые были описаны особенности опухолевых

клеток.

Первая особенность – способность к бесконечному делению.


В 50-ые годы ХХ века была получена перевиваемая клеточная культура раковых клеток опухоли

молочной железы.

Культура получила название HeLa по инициалам оперированной пациентки. Эти клетки живы до

сих пор, и с ними работают во многих лабораториях мира. За прошедшие годы ученые вырастили

тонны этих клеток, хотя самой пациентки давно уже нет.


Другая особенность раковых клеток – отсутствие контактного торможения. Они не прекращают

делиться, заполняя всю поверхность сосуда. Клетки наползают друг на друга, могут образовывать

второй и третий слой.

Ослабленным контактным торможением характеризуются

раковые клетки


Раковые клетки продолжают расти и

после того, как заполнят всю поверхность

субстрата, образуя мультислой.

Нетрансформированные

нормальные

клетки могут

делиться

ограниченное


количество раз.

Микрофотография

(сканирующий электронный

эпидермальная карцинома

человека. Стрелками показаны

места «наползания» клеток друг

на друга

Клеточная терапия болезней


миокарда

1. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота)

2. Зигота делится надвое

3—4. Митотическое деление

продолжается

5. Через 5 дней образуется бластоциста


— шарик из клеток, наружный слой

которого должен дать начало плаценте,

а внутренний — всем тканям нового

организма

6. Внутреннюю часть бластоцисты

помещают на питательную среду


7. Используя разные химические

сигналы, стволовые клетки превращают

в клетки разных тканей: мышечные,

эпителиальные, костного мозга и другие

8. Клетки — предшественники миоцитов

(клеток сердечной мышцы) впрыскивают

вблизи очага поражения, чтобы они

устранили дефект

38. Дифференциация адвентивных почек в каллусной ткани

Через каллусную культуру

успешно размножаются

сахарная свекла, злаковые

капустные, подсолнечник и

другие культуры.

Растениерегенерант твердой


пшеницы

Каллус — особая ткань,

состоящая из недифференцированных

клеток

Каллус на


питательной среде

39. Культуры in vitro тканей растений органогенез

Дифференциация побегов из каллуса

яблоня

Микроклональное размножение –

размножение растений in vitro, «в

пробирке».


Его преимущество перед другими способами

получение генетически однородного посадочного материала;

освобождение растений от вирусов; высокий коэффициент

размножения (от 104 для хвойных до 106 — для травянистых

растений);

сокращение продолжительности селекционного процесса;

ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной

фазе развития;

размножение растений, трудно размножаемых традиционными


способами;

возможность проведения работ в течение всего года;

возможность автоматизации процесса выращивания.

Источник: https://kono-pizza.ru/tsitologiya/metody-sovremennoy-tsitologii/

Методы современной цитологии

Методы в современной цитологии

Цитология возникла как ветвь микроанатомии, и поэтому основной метод, который используют цитологи – это метод световой микроскопии. В настоящее время этот метод нашел целый ряд дополнений и модификаций, что значительно расширило круг задач и вопросов, решаемых цитологией.

Революционным моментом в развитии современной цитологии и биологии вообще было применение электронной микроскопии, открывшей необычайно широкие перспективы.

С введением электронной микроскопии в ряде случаев уже трудно провести границу между собственно цитологией и биохимией, они объединяются на уровне макромолекулярного изучения объектов (например, микротрубочек, мембран, микрофиламентов и т.д.).

Все же главным методическим приемом в цитологии остается визуальное наблюдение объекта. Кроме того, в цитологии применяются многочисленные приемы препаративной и аналитической биохимии, методы биофизики.

Познакомимся с некоторыми методами цитологических исследований, которые для удобства изучения разделим на несколько групп.

I. Оптические методы.

1. Световая микроскопия. Объекты исследования – препараты, которые можно рассматривать в проходящем свете. Они должны быть достаточно прозрачны, тонки и контрастны. Биологические объекты не всегда обладают этими качествами.

Для изучения их в биологическом микроскопе необходимо предварительно приготовить соответствующие препараты путем фиксации, обезвоживания, изготовления тонких срезов, окрашивания. Клеточные структуры в таких фиксированных препаратах не всегда соответствуют истинным структурам живой клетки.

Их изучение должно сопровождаться изучением живого объекта в темнопольном и фазово-контрастном микроскопах, где контрастность повышается за счет дополнительных устройств к оптической системе.

Предельное разрешение, которое может дать биологический микроскоп при масляной иммерсии, – 1700 Ǻ (0,17 мкм) в монохроматическом свете и 2500 Ǻ (0,25 мкм) в белом свете. Дальнейшее увеличение разрешения может идти лишь за счет уменьшения длины волны света.

2. Темнопольная микроскопия. Метод основан на принципе рассеивания света на границе между фазами с разными показателями преломления. Достигается это в темнопольном микроскопе или в обычном биологическом микроскопе специальным темнопольным конденсором, который пропускает только очень косые краевые лучи источника света.

Поскольку краевые лучи имеют сильный наклон, они не попадают в объектив, и поле зрения микроскопа оказывается темным, а объект, освещенный рассеянным светом, кажется светлым. На препаратах клеток обычно содержатся структуры разной оптической плотности.

На общем темном фоне эти структуры четко видны благодаря их различному свечению, а светятся они потому, что рассеивают попадающие на них лучи света ( эффект Тиндаля).

В темном поле можно изучать живые объекты. Разрешающая способность такого микроскопа большая (меньше 0,2 мкм).

3. Фазово-контрастная микроскопия. Метод основан на том, что отдельные участки прозрачного препарата отличаются от окружающей среды по показателю преломления. Поэтому проходящий через них свет распространяется с различной скоростью, т.е.

испытывает смещение фаз, что выражается в изменении яркости.

Частицы с показателем преломления, большим показателя преломления среды, дают темные изображения на светлом фоне, с показателем, меньшим показателя среды, – изображения более светлые, чем окружающий фон.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет выявить множество деталей и особенностей живых клеток и срезов тканей. Большое значение имеет этот метод для изучения тканей, культивируемых in vitro.

4. Интерференционная микроскопия. Этот метод близок к методу фазово-контрастной микроскопии и дает возможность получить контрастные изображения неокрашенных прозрачных живых клеток, а также вычислить сухой вес клеток.

Интерференционный микроскоп устроен так, что пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект и приобретает изменения в фазе колебания, другой идет, минуя объект.

В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности.

В этом приборе, измеряя сдвиги фаз, можно определить концентрацию и массу сухого вещества в объекте.

https://www.youtube.com/watch?v=NIRCkWaysjE

Дата добавления: 2015-02-16; просмотров: 7 | Нарушение авторских прав

lektsii.net – Лекции.Нет – 2014-2020 год. (0.008 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав

Источник: https://lektsii.net/2-40012.html

Скрининговые методы современной цитологии в ветеринарии: применение жидкостной цитологии и клеточного блока в морфологии

Методы в современной цитологии

Скрининговые методы современной цитологии, такие как жидкостная цитология и метод клеточного блока, внедрены для создания условий по стандартизации преаналитического этапа и обеспечения качества цитологического исследования в ветеринарии.

Введение

Клиническая цитология изучает клеточный состав патологических процессов. Она стала неотъемлемой частью клинического обследования животных в практике ветеринарного врача. Цитологический метод технически прост, быстр, сравнительно дешев, малотравматичен и практически безболезненен, при его использовании доступна любая локализация в организме  животного.

Однако следует отметить, что успех цитологической диагностики, помимо квалификации цитолога, во многом зависит от того, каким образом был получен материал, как он был обработан, и насколько точно было составлено сопроводительное направление с описанием места локализации исследуемого патологического участка. Важны и другие моменты преаналитического этапа до поступления в цитологическую лабораторию.

Преаналитический этап – один из основных этапов, на котором происходит (зачастую неконтролируемое) снижение контроля качества в лабораторной и цитологической диагностике.

Для создания условий по стандартизации преаналитического этапа и обеспечения качества цитологического исследования внедрены современные методы получения материала, подготовки и доставки проб.

Жидкостная цитология

В последние годы, помимо рутинных (классических) цитологических мазков на стекле, для получения качественных монослойных цитологических препаратов используется жидкостная система, как один из методов снижения негативных факторов и недостатков преаналитического этапа.

Преимущества жидкостной цитологии

Применение методики жидкостной цитологии имеет ряд преимуществ:

  1. Стандартизирует метод изготовления цитологического мазка в условиях лаборатории.
  2. Способствует доставке пробы в лабораторию в оптимальных условиях.
  3. Обеспечивает сохранность клеточных структур. Материал можно хранить от недели до нескольких месяцев, так как в консерванте он устойчив к колебаниям температуры (НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!).
  4. Уменьшает внешнюю загрязненность цитологического образца – фон мазка (лизис эритроцитов, фильтрация слизи и др.).
  5. Позволяет сделать несколько цитологических препаратов из 1 пробы. Клетки сосредотачиваются в одном поле (экономия клеточного материала), что сокращает время просмотра препарата и значительно экономит дорогостоящие сыворотки при проведении иммуноцитохимического исследования.
  6. Влажная фиксация препарата в консерванте, содержащем производные спиртов, сразу после взятия цитологического образца может применяться при окраске по Папаниколау (гормональный фон мазка).
  7. В некоторых консервирующих средах клеточный материал пригоден для дополнительных лабораторных исследований (генетически-молекулярных, ИЦХ, ЦХ и др.).

Недостатки жидкостной цитологии

К недостаткам методики жидкостной цитологии по сравнению с классической цитологией можно отнести: трудозатратность метода в случае, если он не автоматизирован; высокую дороговизну закрытых систем; необходимость в подтверждении клеточности; возможность искажений и артефактов клеток в консерванте; специальное обучение врача-морфолога.

Клинические случаи применения метода жидкостной цитологии

В нашей практике исследовано 32 гастробиоптата с применением скрининговых методик (жидкостная и классическая цитология) предварительного цитологического заключения с последующим гистологическим диагнозом. Данные методики позволяют сообщать врачу предварительные морфологические заключения и определить тактику лечебного процесса до гистологического заключения.

Клинический случай №1

Кот, 12 лет, порода: метис.

В анамнезе хроническая рвота. При гастроскопии выявлен отек слизистой с точечными петехиями слизистой.

Заключение: хронический неактивный гастрит с очаговой тонкокишечной метаплазией эпителия.

Жидкостная цитология х400, окраска по Папаниколау. Дисрегенеративная диспластическая гиперплазия.

Традиционный цитологический мазок х400 (отпечаток), окраска Паппенгейма.
Дисрегенеративная диспластическая гиперплазия.

Гистологический препарат х100 (компьютерная сшивка). В отечном биоптате в поверхностных отделах слизистой имеется слабо выраженная лимфо-плазмоцитарная и гистиоцитарная инфильтрация, очаговый фиброз и тонкокишечная метаплазия эпителия.

Клинический случай №2

Кот, 9 лет, порода: персидская.

Новообразование кожи 2×2,5 см с кистозными полостями. Под кистами выявлено уплотнение толщи кожи. Произведено пунктирование патологического участка.

Заключение: плоскоклеточный рак (возможно, аденопластический вариант). Требуется фенотипирование!

Новообразование толщи кожи с кистами.

Жидкостная цитология х400, окраска по Папаниколау. Комплексы опухолевых эпителиальных клеток с признаками умеренного полиморфизма, нарушенным рисунком хроматина ядра. Характеристики неороговевающего плоскоклеточного рака с кистозной дегенерацией.

Традиционный цитологический мазок х400 (пунктат), окраска Паппенгейма.

Ядра клеток слабо полиморфные с признаками конденсирования хроматина. Большая часть клеток округлой формы, выявлены единичные клетки с полигональной формой.

Жидкостная цитологии делает возможным использовать клеточный материал в последующих исследованиях методом клеточного блока (cell-block), при котором получаются препараты, занимающие промежуточное положение между цитологическими и гистологическими методами морфологии.

Клеточный блок (cell-block)

Клеточный блок – это агрегация клеточно-тканевых фрагментов (клочков ткани) с последующими изготовлением гистологического среза и окраской, позволяющая производить морфологическую оценку.

Таким образом метод жидкостной цитологии позволяет сохранить тонкоигольный биоптат для гистологического исследования.

Клеточные срезы  интерпретируются по гистологическим критериям: фрагменты тканевых структур, архитектоника ткани, которая облегчает оценку материала по нескольким разделам гистогенеза. Как правило, данная морфологическая картина не доступна в цитологических мазках.

Методика cell-block, разработанная еще в 70-х годах, стала популярна в последние 10 лет вместе с поиском и внедрением стандартов иммунологических окрасок цитологических образцов.

В настоящее время это один из методов, позволяющий проводить иммуногистохимическое исследование цитологического образца в иммуностейнерах (стандартизированные автоматы для окраски мазков, срезов).

Иммуноцито(гисто)химическое исследование нередко является решающим в дифференциальной диагностике новообразований, когда при рутинном исследовании возникают непреодолимые трудности в установлении гистогенеза отдельных опухолей, определении источника метастазирования, трактовке первично-множественных поражений.

Преимущества клеточного блока имеют дополнительную ценность при поиске щадящих методов диагностики в случаях неоперабельных или обнаруженных в терминальных стадиях злокачественных опухолей, или при взятии материала из трудно исследуемых участков, выпотах и др.

К сложностям в работе с клеточным блоком можно отнести трудозатратность методики, высокую дороговизну автоматизации и роботизации процесса, необходимость подтверждения клеточности, что требует дополнительного изготовления мазка методом  жидкостной цитологии, а также возможность искажений и артефактов. Кроме того, требуется согласованная работа цитолога и гистолога.

Хотите научиться технологии cell-block под руководством наших специалистов?

Тогда приезжайте к нам учиться.

Курс «Гистология Одного Дня»
научит этому и многим другим техникам и хитростям из нашей повседневной практики.

Клинические случаи применения метода клеточного блока

Уже несколько исследований, проведенных с применением метода клеточного блока, позволили произвести щадящую диагностику и фенотипирование опухолевых процессов с последующим назначением химиотерапевтического лечения животным в разных стадиях опухолевого поражения.

Клинический случай №3

Собака, кобель, 11 лет, порода: той-пудель.

Выявлено новообразование переднего пакета молочной железы размером 3х5 см, подвижное, бугристое, безболезненное, с гиперемией участков кожи в области соска.

Лимфатический узел (2 стеклопрепарата) – материал клеточный; среди элементов крови и большого количества макрофагов одиночные клетки и солидные комплексы с выраженной атипией, нарушением ядерно-цитоплазматического соотношения, многочисленными крупными хорошо выраженными ядрышками, глыбчатым хроматином, многочисленными фигурами митозов, в том числе, патологических.

Заключение: Цитологическая картина и иммунофенотип соответствуют низкодифференцированной аденокарциноме молочной железы с высоким потенциалом злокачественности с метастазом в лимфатический узел.

Новообразование переднего пакета молочной железы размером 3х5 см.

Жидкостная цитология х400, окраска по Папаниколау. Клеточный материал представлен одиночными клетками и солидными комплексами с признаками атипии, нарушением ядерно-цитоплазматического соотношения, многочисленными крупными хорошо выраженными ядрышками, глыбчатым хроматином.

Традиционный цитологический мазок х400 (пунктат), окраска Паппенгейма.

Представлен одиночными клетками, солидными и ацинарными комплексами с выраженной атипией, нарушением ядерно-цитоплазматического соотношения, многочисленными крупными хорошо выраженными ядрышками, глыбчатым хроматином, многочисленными фигурами митозов, в том числе, патологических. Фон: элементы крови, макрофаги, нейтрофильные лейкоциты, плазматические клетки.

Cell-block х100 (компьютерная сшивка), окраска гематоксилин-эозином. Одиночные клетки и солидные комплексы атипичных клеток.

Cell-block х100 (иммуногистохимия), окраска с положительной экспрессией АЕ1/АЕ3(+++). Отрицательная экспрессия Melan A, CD45, Mammaglobin, ER, PR, Chromogranin. Индекс пролиферативной активности выше ~40%.

В совокупности цитологический метод и cell-block позволяют в динамике, не травмируя пациента, изучать лечебный патоморфоз при химиолучевой и фотодинамической терапии.

Клинический случай №4

Кошка, 5 лет, порода: метис.

Округлое новообразование кожи в области правого верхнего века с участком аллопеции размер 4х4 см. После дренажирования замечено увеличение и болезненность. Произведено пунктирование патологического участка.

Заключение: Микотическая гранулема (криптококкоз – cryptococcosis).

Округлое новообразование кожи с участком аллопеции размер 4х4 см.

Жидкостная цитология х400, окраска по Папаниколау. Участок слизи с грибками, морфологически схожими с криптококками.

Традиционный цитологический мазок х400 (пунктат), окраска Паппенгейма.

Микотические колонии, морфологически схожие с криптококками.

Cell-block х100 (компьютерная сшивка), окраска гематоксилин-эозином. Множественные клетки воспаления и внутрицитоплазматические включения грибковых тел в нейтрофилах и макрофагах.

Выводы

Наш опыт показывает, что использование методов жидкостной цитологии, проведения дополнительных цитологических окрасок (по Папаниколау), изготовления клеточных блоков (cell-block) и иммуноцито(гисто)химической диагностики, как правило, позволяет:

  • частично стандартизировать цитологический метод,
  • снизить ошибки преаналитического этапа,
  • выявить достаточные признаки для постановки более определенного, достоверного заключения.

Литвинов Николай Валерьевич, КВН, научный сотрудник Лаборатории молекулярной медицины ГБОУ ВПО СПбГМУ им. И.П. Павлова Минздравсоцразвития России, член ESVCP, эксперт-консультант Органа по сертификации качества Российской Метрологической Академии в системе Ростехрегулирования РФ, научный руководитель коллегиальной экспертизы «CYTOVET», эксперт ООО КФ «Микроскоп Плюс» г. Санкт-Петербург.

Источник: https://cytovet.ru/stati/skriningovye-metody-sovremennoj-citologii-v-veterinarii/

Консультация доктора
Добавить комментарий