Окраска цитологических препаратов

7.Приготовление цитологического мазка, правила фиксации и окраски. Теория цитологических окрасок

Окраска цитологических препаратов

Техникаприготовления мазковПолученноеколичество материала не всегда определяетвозможности диагностики, иногда оченьмалое количество материала являетсядостаточным для постановки диагноза.

Наличие большого количества крови частоявляется помехой.

При её наличии мазкинеобходимо делать как можно скорее,иначе наступает свертывание и изсвернувшегося сгустка очень трудносделать мазки и провести исследование.

Материал наносятна стекло и очень аккуратно делаютмазки, т. к. клетки очень ранимы, а наличиебольшого количества разрушенных клетокмешает правильной диагностике.

Правильноприготовленный мазок из нормальной илипатологической измененной ткани долженотвечать следующим условиям:

  • Мазок должен начинаться на 1 см от узкого края предметного стекла и заканчиваться примерно в 1,5 см от другого края предметного стекла; мазок не должен достигать длинного края стекла, между мазком и краем предметного стекла должно оставаться расстояние примерно 0,3 см.
  • Хороший мазок должен быть максимально тонким (максимально приближающимся к однослойному), равномерной толщины (не волнообразным) на всём протяжении.
  • Мазок из осадка жидкого материала (жидкость из серозной полости, смыв из различных органов, содержимое кистозной полости и т.п.) должен заканчиваться у одного из узких краёв предметного стекла в виде следа, оставленного как бы тонкой щёткой.
  • Клетки в мазке должны быть равномерно распределены, все участки мазка должны хорошо просматриваться и не содержать «толстые участки», содержащие непросматриваемые (плохо просматриваемые) скопления или комплексы клеток.

Изжидких пунктатов мазкиготовят подобно мазкам крови, еслиполученная масса плотная или комковатая,то помимо мазков можно приготовить иотпечатки на стекле.

Метод отпечатковимеет определенные преимущества.

  • Во-первых, клетки подвергаются гораздо меньшему травматизму.
  • Во-вторых, есть возможность расположения клеток пластами, что помогает при описании цитологического препарата характеризовать и соотношение клеток между собой.
  • В-третьих, если материал богат кровью, его необходимо нанести на стекло и тогда выбирать оттуда “беленькие крупинки” и ими делать мазки.

Метод отпечатковприменим при использовании цитологическогометода во время операционноговмешательства, а так же получениибиопсии. Этот метод может быть использован,как самостоятельно, так и параллельнос гистологическим анализом.

В этихслучаях помимо пункций проводят получениеотпечатков с удаленных или обнаженныхорганов, с помощью прикосновения стеклапредметного к исследуемой ткани.

Также можно готовить препараты при полученииматериала методом соскоба

Жидкости,полученные при пункции,тут же центрифугируют, далее сливаютверхний слой из центрифуги, а из осадкаделают  мазки, которые и подвергаютцитологическому исследованию. В некоторыхслучаях приготовленные препараты можнопросмотреть под микроскопом, однакодиагностику патологии необходимопроводить только по окрашенномупрепарату.

Длядифференциальной диагностики используютцитохимические методики. Чтобы установитьхарактер секреции и межуточного вещества,используют окраски, применяемые вгистологии (мукармин для выявленияслизи, окраска пикрофуксином длявыявления коллагена, остеоида).

Если материаладостаточно, клетки сохраненные, хорошоприготовлен и окрашен препарат, даетсязаключение о гистологической форме суказанием степени дифференцировки(низкодифференцированная аденокарцинома,плоскоклеточный ороговевающий рак). Втех случаях, когда материал и цитологическаякартина недостаточно убедительна дляустановления конкретного диагноза,дается описание препарата, отдельныхклеточных элементов и, при возможности,их оценка.

Необходимойпредпосылкой для точной оценкиморфологических особенностей клетокв мазке  является правильносделанный, качественно фиксированный,хорошо окрашенный и методологическикорректно изученный мазок, поступающийв лабораторию в сопровождении необходимыхклинико-инструментальных и анамнестическихданных. Невыполнение этих условий ведетк неправильному распределению клетокткани, неполному выявлению ихморфологических особенностей, «пропуску»важной диагностической информации напредметном стекле или отсутствиюкорригирующей клинической информациии, тем самым, к ошибочной оценкецитологической картины, а значит кнеполноценному или ошибочного диагнозу.Если мазки были приготовлены внелаборатории, то в соответствии с темиже требованиями оценивается ихмакроскопический вид. Сотрудникилаборатории должны постоянно обучатьпредставителей клинических отделений,участвующих в приготовлении мазков.

Приготовлениестекол

Стекла дляприготовления цитологических препаратовдолжны быть чистые, обезжиренные исухие.

1. Стекла тщательнопромывают щеткой в теплой мыльной (илис моющим средством) воде.

2. Основательнопромывают в проточной теплой воде.

3. Затем кипятят1—2 часа в воде с добавлением соды (2—3%)или моющего средства.

4. После хорошоополаскивают в чистой горячей воде ипромывают в проточной (1—2 часа).

Обработанные ипромытые в воде стекла протирают мягкойтряпкой, держа стекла за края, и хранятв смеси Никифорова (равные части 96°спирта и эфира). По мере надобностипинцетом извлекают стекла из смесиНикифорова и протирают сухой тряпкой.Обработанные таким образом стекла могутбыть использованы для приготовленияцитологических препаратов.

Дляпроведения цитохимических исследований оченьхорошие результаты дает обработкапредметных стекол и других стеклянныхпредметов в хромовойсмеси следующегосостава:

Двухромовокислыйкалий (бихромат калия) — 100 г; вода горячая— 1000 мл; неочищенная серная кислота —100 мл.

Дляприготовления хромовой смеси растворяютв горячей воде двухромовокислый калий,затем охлаждают раствор и после этогодобавляют серную кислоту.

Кислоту льютосторожно (обязательно в вытяжномшкафу), при этом смесь весьма сильнонагревается и приобретает темно-коричневыйцвет.

В этом составе предметные стеклаи другую стеклянную посуду выдерживают2—3 дня, а после промывают в проточнойводе в течение 1—2 часов.

На хорошо обезжиренномпредметном стекле вода должна растекатьсятонким слоем, а не собираться в капли.

Фиксация

Фиксация мазкапроводится в соответствии с методикой,обусловленной биологическимматериалом, взятием  дляцитологического исследования  (влажная фиксация биологическогоматериала  или  подсушиваниеего на воздухе). При влажной фиксацииприготовленный мазок помещается вфиксирующую жидкость, затем подсушиваемна воздухе. Недостаточная фиксациямазка ведет к некачественному окрашиваниюклеток.

  1. Правильная фиксация мазка  обусловливает стойкость клеток по отношению к содержащейся  в красках  воде, которая  в нефиксированном мазке изменяет строение клеточных элементов. При фиксации мазка происходит коагуляция белка, в результате чего клетки прикрепляются к предметному  стеклу;

  2. При фиксации цитологических препаратов должны использоваться фиксаторы: метиловый спирт, этиловый спирт, смесь Никифорова, фиксатор Май- Грюнвальда, фиксатор Лейшмана, ацетон (для иммунноцитохимии).

Еслиэто специально не оговорено методикой,то, как правило, фиксируют высушенныемазки. Лучшим фиксатором для цитологическихпрепаратов является метанол.В метаноле фиксацию проводят от трехдо десяти минут.

Крометого, для фиксации может бытьиспользован этиловыйспирт 100°.Время фиксации составляет 10—30 минут.

Вкачестве фиксатора может использоваться смесьНикифорова (времяфиксации минимум 15 минут, максимум 1—2часа). Некоторые красители (Лейшман,Май-Грюнвальд) являются одновременнофиксаторами.

Окраскацитологических препаратов

Качественноеокрашивание позволяет правильноидентифицировать клеточные элементымазка и оценить их особенности примикроскопии. В адекватно окрашенноммазке структуры цитоплазмы,  ядра,ядерного хроматина, ядрышек окрашеныэлективно.

  1. При применении любой методики окрашивание мазка важно точно соблюдать последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки времени в течение процесса окрашивания.

  2. Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность окраски.

    Это обязывает опытным путём установить оптимальные концентрации (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, который устанавливает при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (рН 6,8 – 7, 2) что обеспечивается использованием буферных растворов.

  3. Рекомендуемые методы окрашивания цитологических мазков: азур – эозиновый, по Романовскому – Гимзе, Лейшману, Маю – Грюнвальду, Паппенгейму; гематоксилин – эозиновый, метод Папаниколау.

  4. Для уточнения диагноза рекомендуется использование цитохимических и иммуноцитохимических методов анализа в соответствии с принятыми методиками.

8.Современныепредставления о гемопоэзе. Доказательтствасуществования родоначальной гемопоэтическойклетки (эксперименты J.TillMcCullach).1907-1909гг. – унитарная (монистическая) теориякроветворения предложена русскимгистологом-цитологом Максимовым.

Онадо сих пор является ведущей теорией,говорит о том, что в основе гемопоэзалежит одна- единственная клетка, дающаяначало всем росткам кроветворной ткани(свойство полипотентности). ПосколькуМаксимов был гистологом, он естественнопытался найти морфологические признакиПСКК.

Максимов считал, что оналимфоцитоподобная, мезенхимная посвоему происхождению.

1961 г.

– Till, McCulloch(Австралия) вводили взвесь костногомозга внутривенно смертельно облученныммышам, у которых в селезенке на 7-14 суткиформировались макроколонии, состоящиеиз разного типа миелоидных элементов(гранулоциты, эритроциты, мегакариоциты,смешанные колонии), впоследствииобнаружены лимфоидные клетки. •Ретрансплантация отдельных колонийтакже приводит к расщеплению и образованиюразных типов колоний – полипотентностьи способность к самоподдержанию КОЕс8-12.

Источник: https://studfile.net/preview/6831671/page:3/

Лекция 12 Тема Распространенные методы окраски цитологических препаратов

Окраска цитологических препаратов

Лекция 12 Тема: Распространенные методы окраски цитологических препаратов.

Ø Наиболее распространенными и чаще применяемыми являются красители, используемые для гематологических исследований. Это краски Романовского-Гимза, Лейшмана, Май-Грюнвальд.

Качество окраски клеточных элементов зависит от: § вида и состава красителя; § его концентрации; § продолжительности окраски; § возраста окрашиваемого препарата (препараты от 6 ч до неск.

дней давности теряют мелкие структурные особенности); § p. H среды (6. 8 – 7. 2).

ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗЕ § Сухие мазки фиксируют в метиловом спирте (5 мин) или в смеси Никифорова (15 мин); § Погружают в рабочий раствор (1: 4) готовой краски Романовского-Гимза на 5 -7 мин; § Промывают дистиллированной водой, высушивают, исследуют при иммерсии. Результат: Бактерии вследствие окрашивания приобретают фиолетово-красный оттенок, цитоплазма клеток — голубой цвет, ядра — красный. Вследствие окраски простейших их цитоплазма становится голубого цвета, а ядра — красно-фиолетового.

1 – эритроциты; 2 – нейтрофильные лейкоциты; 3 – базофильный лейкоцит; 4 – эозинофильный лейкоцит; 5 – лимфоцит; 6 – моноцит. Кровь человека (мазок) Окраска: по Романовскому-Гимзе

ОКРАСКА МАЗКОВ ПО ЛЕЙШМАНУ § Приготовление краски Лейшмана: 2, 5 г сухого красителя на 1 л метилового спирта. Созревает 3 -4 дня. Готовый раствор фильтруют.

§ ü ü ü Методика окраски: высушенные мазок опускают в краску Лейшмана на 3 мин. ; промывают водой; заливают красителем, состоящим из 40 мл азура, 30 мл эозина, 70 мл дистил. воды (краску готовят перед работой!).

Окрашивают мазки 30 -40 мин. ; ü промывают водой и высушивают.

ОКРАСКА МАЗКОВ ПО ПАППЕНГЕЙМУ § Красители: 1. Фиксатор Май-Грюнвальда: 250 мг порошка + 100 мл метилового спирта. Раствор греют (70°) на водяной бане, фильтруют и хранят в бутылке. 2. Рабочий р-р готовой краски Романовского-Гимза (1 мл краски+4 мл дистил. воды).

§ Ход окрашивания: 1. На мазок наливают краску-фиксатор Май-Грюнвальда на 3 мин. ; 2. Не сливая краски добавляют тоже количество дистил. воды; 3. Через 1 мин краску сливают и сразу добавляют краску Романовского-гимза на 5 -15 мин. ; 4. Промывают дистил.

водой и высушивают.

Пунктат молочной железы. Фиброзно-кистозная болезнь Структуры из клеток при доброкачественных состояниях. Структура в виде вытянутой трубочки, состоящей из двух рядов клеток, с эксцентрическим расположением ядер и просветом в центре (1). «Голое» ядро разрушенной клетки (2). Окрашивание по Паппенгейму

Окраска гематоксилин-эозином Сочетает в себе основной и кислый красители (ядра приобретают сине-фиолетовый цвет, цитоплазма – желтовато-розовый).

ВИДЫ ГЕМАТОКСИЛИНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ Ø Гематоксилин сам по себе не является красящим веществом. Ø Для приготовления краски, гематоксилин подвергают окислению. В результате он превращается в красящее вещество – гематеин (сине-фиолетовый краситель).

Кислый гематоксилин Эрлиха 2 г гематоксилина + 100 мл 96° спирта + 100 мл дистил. воды + 100 мл глицерина + 3 г калийных квасцов + 10 мл ледяной уксусной кислоты. Краситель «созревает» 14 дней.

Продолжительность окрашивания 4 -6 мин.

Кислый гематоксилин Майера Состав: гематоксилин алюмокалиевые квасцы йодноватокистый калий стабилизаторы консервант дистиллированная вода Продолжительность окрашивания 5 -10 мин.

Кислый гематоксилин Карацци 400 мл воды + 100 мл глицерина + 0, 5 г гематоксилина + 25 г алюмокалиевых квасцов + 0, 03 г КJО 3. Созревание 1 нед. Продолжительность окраски препаратов 1 -2 часа. Приготовление эозина 0, 1 г эозина растворяют в 100 мл дистиллированной воды

Методика окраски гематоксилин-эозином: § высушенные мазки фиксируют в смеси Никифорова (1015 мин); § окрашивают раствором гематоксилина (7 -10 мин); § промывают в проточной воде 1 -2 мин; § окрашивают 1% водным раствором эозина (1 мин); § промывают в проточной воде 1 -2 мин и высушивают.

Эмпирический метод выбора продолжительности окраски мазка гематоксилином: q Ядра окрашены в светло-фиолетовый цвет без четкого различия структур – препарат недокрашен. Необходимо увеличить время окраски.

q Ядра темно-фиолетовые, цитоплазма тоже окрашена – препарат перекрашен. После промывания в дистил. воде на неск. секунд помещают в 70% спирт и под контролем микроскопа следят за ослаблением окраски.

q Ядра красно-фиолетовые с четко выраженным ядрышком и хроматином, цитоплазма практически не окрашена – окраска нормальная.

Микрофотография исходного (фиксированного и высушенного) препарата. Окраска гематоксилином. Цвет окраски ядер близок к фиолетовому; цитоплазма – слабо окрашена в голубой цвет; фон препарата приобретает сероватоголубой цвет.

Эмпирический метод выбора продолжительности окраски мазка эозином: q Цитоплазма едва розовая – препарат недокрашен.

Для усиления красящих свойств эозина его подкисляют уксусной кислотой (1 капля 3% уксусной кислоты на 100 мл эозина); q Фон красного цвета, микроструктуры видны нечетко – препарат перекрашен.

Лишняя окраска удаляется промыванием. q Фон умеренно розовато-желтого цвета – окраска удачная.

Микропрепарат мокроты. Эластические волокна в виде тонких розовых нитей; окраска эозином.

ОКРАСКА ПО ПАПАНИКОЛАУ ü является мировым стандартом в скрининге рака шейки матки, используется для выявления предраковых заболеваний.

Мазок из шейки матки. Норма. Мазок из шейки матки. Рак. Клетки плоского эпителия среднего и мелкого размера; ядра разные по размерам, неправильной формы; хроматин распределен неравномерно. Окрашивание по Папаниколау.

МЕТОД ЖИДКОСТНОЙ ЦИТОЛОГИИ ü Для жидкостной цитологии на анализ берут соскоб с шейки матки и цервикального канала. ü Полученный материал врач помещает в специальный контейнер, заполненный стабилизирующей жидкостьюконсервантом.

Именно поэтому метод и называется жидкостной цитологией.

ü Контейнер с биологическим материалом помещают в специальный аппарат, где в автоматическом режиме происходит выделение клеток в образец и помещение его на предметное стекло с последующим окрашиванием по Папаниколау.

Источник: https://present5.com/lekciya-12-tema-rasprostranennye-metody-okraski-citologicheskix-preparatov/

Консультация доктора
Добавить комментарий