Окраска гематоксилин эозином цитология

Окраска цитологических мазков по романовскому — АНТИ-РАК

Окраска гематоксилин эозином цитология

  1. Удаляют парафин из срезов в орто-ксилоле или толуоле, проводят по спиртам нисходящей концентрации и доводят до воды (две порции ксилола или толуола – 3-5 минут, 96° этанол – 3 минуты, 80° этанол – 3 минуты, 70° этанол – 3 минуты, дистиллированная вода – 5 минут).
  2. Окрашивают гематоксилином 7-10 минут (в зависимости от зрелости красителя).
  3. Промывают в дистиллированной воде – 5 минут.
  4. Дифференцируют в 1% соляной кислоты на 70° этаноле до побурения срезов.
  5. Промывают дистиллированной водой, а затем слабым (0,5 %) раствором аммиака до посинения срезов.
  6. Окрашивают водным раствором эозина 0,5-1 минуту (в зависимости от желаемой окраски).
  7. Промывают в трех порциях дистиллированной воды для удаления избытка эозина.
  8. Удаляют воду из срезов в одной порции 70° этанола, двух порциях 96° этанола. Экспозиция в каждой порции спирта – 2 минуты.
  9. Просветляют срезы в двух порциях карбол-ксилола (смесь расплавленного фенола и ксилола либо толуола в соотношении 1:4 или 1:5) – 1 минута.
  10. Производят окончательное обезвоживание срезов в двух порциях ксилола или толуола. Пребывание срезов 2 минуты.
  11. Заключают срезы в канадский бальзам или синтетическую среду для заключения гистологических срезов.

Некоторые структуры плохо прокрашиваются гематоксилином и эозином (как правило гидрофобные) и требуют иных методов окраски.

Например, участки клеток, богатые липидами и миелином, остаются неокрашенными: адипоциты, миелиновая оболочкааксоновнейронов, мембрана аппарата Гольджи и др.

Классические методы окраски мазков крови

Мазки крови, высушенные на воздухе, окрашиваются специальными красителями с целью идентификации цитоморфологически важных структур в клетках крови.

    Кислые вещества клетки (выглядят базофильными) связывают основные красители.

Основные клеточные субстанции (ацидофильные) окрашиваются кислыми красками.

Нейтральные компоненты клетки визуализируются при помощи нейтральных растворов-красителей.

Краситель состоит из щелочной части (азур II — ярко-синий цвет), и кислой части (эозин — розово-красный цвет).

В настоящее время используется готовый краситель Романовского-Гимзе, из которого перед началом работы готовят рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.

Высохший фиксированный мазок помещается в кювету с рабочим раствором краски на 25-40 минут (конкретное время устанавливается опытным путем для каждой партии красителя).

    Ядра клеток — красно-фиолетовые; Эозинофильные гранулы — красновато-коричневые; Базофильные гранулы — синие; Нейтрофильные гранулы — фиолетовые; Цитоплазма лимфоцитов — голубая; Эритроциты — бледно-красные; Тромбоциты — наружная часть синяя (более светлая); внутренняя — фиолетовая (более темная).

Данный метод очень удобен для визуализации гранулоцитов.

Для окрашивания применяется готовый раствор эозинметиленового синего по Маю-Грюнвальду. Мазок без предварительной фиксации заливают красителем, через 5 минут промывают и высушивают.

    Лимфоциты — ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: голубая; Моноциты — ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: серо-голубая; Гранулоциты — ядра: сине-фиолетовые; гранулы: красные, фиолетовые, темно-синие (зависит от типа); Тромбоциты — наружная часть голубая; внутренняя — фиолетовая; Эритроциты — розовые.

Представляет собой комбинацию двух предыдущих методов.

Сухие нефиксированные мазки помещаются в кювету с раствором Мая-Грюнвальда на 3..5 минут. После этого контейнер с мазками ополаскивается дистиллированной водой, после чего мазки помещаются в кювету с разведенным раствором Романовского-Гимзы на 20..30 минут. После этого мазки промываются проточной водой и высушиваются.

    Ядра клеток — красно-фиолетовые; Цитоплазма лимфоидных клеток — светло-синяя; Лимфоидная азурная грануляция — ярко-синяя; Миелоидная азурная грануляция — фиолетовая; Нейтрофильные гранулы — светло-фиолетовые; Эозинофильные гранулы — красные, красно-коричневые; Базофильные гранулы — темно-фиолетовые, черные; Эритроциты — розовые (полихроматофильные эритроциты — синеватые); Тельца Жолли — красновато-фиолетовые; Тельца Ауэра — ярко-красные.

Окраска по Райту

На сухой нефиксированный мазок наносится 1 мл красителя, через 1 минуту добавляется 1 мл дистиллированной воды. Через 2..3 минуты промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе. Окраска аналогична предыдущему методу.

В красящих смесях Романовского и сходных с ним прописей Гимзы, Райта, Лейшмана в качестве ядерных краси телей используют тиазины.

В их ряду — тионин-анилиновый краситель и его моно-, ди-, три — и тетраметилпроизводные азур С, азур А и азур В, метиленовый синий — широко применяются в цитологических исследованиях как ценные ядерные красители со свойством метахромазии для эксфолиативной и пункционной цитологии, для клеток крови, костного мозга, окрашивания бактерий.

Сочетание тиазинов с красителями эозиновой группы дает известную много вариантность методов. Красители типа Романовского, названные по именам авторов, которые стремились добиться стабильности состава тиазинов (Гимза, Лейшман, Дженнер, Май-Грюнвальд, Мак Нил, Райт и др.), в принципе дают сходные результаты окрашивания.

Результаты окрашивания мазков крови: цитоплазма лимфоцитов окрашивается в светло-синий цвет, их ядра — в цвета от интенсивно пурпурного до фиолетового, ядра моноцитов в более светлый пурпурно-красный, их цитоплазма в мутный голубовато-серый, грануломеры тромбоцитов в красный, гиаломеры — в голубой, гранулы базофилов — в интенсивный сине-фиолетовый цвет, гранулы эозинофилов — в оранжево-розовый, а нейтрофильных лейкоцитов — в цвета от пурпурного до фиолетового.

Референтным признается метод Романовского, состоящий из азура В и эозина Y.

Азур-эозиновые красители позволяют четко определять ранние некробиотические изменения в клетках, поскольку обычный светло-голубой оттенок цитоплазмы резко меняется на светло-розовый.

В синий цвет обычно окрашиваются ядра, бактерии, риккетсии, тигроид и рибонуклеопротеиды, в голубовато-фиолетовый — гранулы тучных клеток и базофилов, цитоплазма зрелых клеток — от голубого до фиолетового и бледно-лилового цвета.

цитоплазма клеток в состоянии некроза и некробиоза — ярко-розовая, секреторные гранулы ацинарных клеток (под желудочной железы, слюнных желез) от розового до красного.

Амилоид, фибрин окрашиваются в розовый цвет, цитоплазма мышечных волокон, коллоид щитовидной железы — в серовато-синий, кератин — ярко-голубой. Эритроциты оранжево-красного цвета.

Окраска мазков по Wright-Giemsa (№ 9990710)

На основе эозинатов полихромного метиленового синего

1. Погрузить предметные стекла в раствор красителя Райт-Гимза на выбранное время (примерно 60 секунд). Не взбалтывать краситель!

2. Осушить или промокнуть свободную часть предметного стекла (или стеклодержатель), чтобы удалить избы ток краски.

3. Погрузить предметное стекло в буферный раствор примерно на то же самое время, что и время в красителе (60 секунд). Увеличение или уменьшение времени пребывания мазка в краске или буфере будет менять окончательный цвет препарата.

4. Осушить или промокнуть свободную часть препарата (или стеклодержатель), чтобы удалить избыток бу фера.

5. Погрузить мазок в раствор очистителя на 2-10 секунд, быстро взбалтывая.

6. Протереть обратную сторону стекла.

7. Высушить окрашенный мазок в вертикальном положении, поставив на адсорбирующую поверхность (напри мер, на фильтровальную бумагу). Не промокать мазок!

8. Нанести каплю масла и исследовать мазок под микроскопом. Результаты: как при окрашивании по Романовскому.

Ускоренный метод Giemsa-Kwik-Diff (№9990700)

Приготовленный мазок высушивают.

Готовят 3 контейнера (сосуды Коплина или кюветы). Наполняют Kwik-Diff раствором № 1 (фиксатор), второй сосуд — раствором № 2, третий — раствором № 3.

1. Погрузить стекла или держатели со стеклами 5 раз (1 секунда на погружение).

2. Дать стечь раствору в сосуд, обсушить край стекла.

3. Погрузить стекла или держатели стекол в раствор № 2,5 раз (одно погружение — 1 секунда). Дать жидкости стечь, обсушить край.

4. Погрузить стекла или держатель со стеклами в раствор № 3 — 5 раз (одно погружение — 1 с). Дать жидкости стечь, обсушить край фильтровальной бумагой.

5. Промыть стекло или держатель со стеклами путем погружения и покачивания в дистиллированной или де-ионизированной воде.6. Высушить на воздухе или использовать теплый воздух сушилки.

Окрашивание мазков гематоксилином-эозином

Могут использоваться различные виды гематоксилинов: Gill, Harris, кислый и неподкисленный.

1. Фиксация мазков в спирте-эфире или 96% этаноле.

2. Окрашивание в гематоксилине Gill 2 (№ 6765007) — 3-5 минут.

3. Промывание в проточной воде 1-2 минуты.

4. Окрашивание в 0,3% спиртовом растворе эозина Y (Instant, Eosin № 6765040) — 1 минуту.

5. Для сохранения микропрепарата рекомендуется заключение в бальзам после обезвоживания в спиртах. Результаты: ядра клеток — сине-фиолетового цвета, цитоплазма, мышечные волокна — различные оттенки розового цвета, муцины — светло-розового, кератогиалины — ярко-розового цвета.

Окрашивание мазков по Граму для выявления бактериальной флоры

1. Фиксация в пламени горелки мазком вниз при круговых движениях — 3 раза. Остудить.

2. Накрыть покровным стеклом с красителем кристаллическим фиолетовым Грама (№ 9990725) — 1 мин.

3. Промыть стекло до чистой промывной воды деионизированной или водопроводной водой.

4. Накрыть покровным стеклом с красителем йодным реагентом по Граму (№ 9990726) — 1 мин.

5. Осторожно промыть стекло деионизированной или водопроводной водой. Дать стечь.

6. Промыть стекло с обесцвечивающим раствором (№ 9990727) до потери окрашивания.

7. Осторожно промыть стекло деионизированной или водопроводной водой 5—10 с.

8. Накрыть покровным стеклом с красителем Safranin О (№ 9990728), подкрашивать 1 мин.

9. Осторожно промыть стекло деионизированной или водопроводной водой 5—10 с до чистого цвета воды.

10. Дать раствору стечь и высушить на воздухе. Можно осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.

11. Исследовать с иммерсией.

Результаты: бактерии темно-фиолетового цвета — грамположительны. Бактерии грам-отрицательные окрашены в розово-красный цвет. Контролем качества окрашивания мазка является сине-фиолетовый цвет ядер лейкоцитов и эпителиальных клеток.

Молекулярно-биологические методы выявления вируса папилломы человека

Тонкослойные препараты — Cytospins — полученные на основе жидкостной цитологии, позволяют внедрить но вые методы для микроскопической диагностики, в частности, иммуноцитохимические, для выявления микроорганизмов в мазках из шейки матки.

Выявление группы риска при исследовании цервикальных мазков и дальнейший мониторинг позволяют уловить процесс озлокачествления на самых ранних стадиях и получить лучшие результаты лечения, а обнаружение HPV при пограничных и неясных изменениях эпителия шейки матки — выбрать адекватную тактику ведения больных.

Для выявления вируса папилломы человека фирма ЛабМетод предлагает ряд методов.

Метод обеспечивает выявление возбудителя внутри клеток. В основе метода лежит специфическое взаимодействие антигена и антитела. Предлагается широкая панель антител как для скрининга на вирус папилломы человека, так и для типирования вирусов, поскольку для эпителия шейки матки особенно «опасными» являются 16 и 18 типы.

Источник: https://kono-pizza.ru/tsitologiya/okraska-tsitologicheskikh-mazkov-gematoksilin-eozinom/

Окраска гематоксилин эозином цитология

Окраска гематоксилин эозином цитология

Электронно-микроскопическая цитохимия, Электронно-микроскопическая иммуноцитохимия и Электронно-микроскопическая

авторадиография

а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата.  б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную

от окраски исходного реактива.

1а) РНКРеакция Браше.1. Реактив (как отмечалось, — смесь двух красителей: метилового зелёного ипиронина.2. а) А. Пиронин специфическиокрашивает РНК в красный цвет.  Б. Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмыимеют красный цвет.б) Другие структуры ядра (помимо ядрышек)— зелёные.3. Обычно делают и контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатываютрибонуклеазой.
1б) ДНКРеакция Фёльгена.1. Основной реактив — фуксинсернистая кислота(реактив Шиффа).2. ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет.
2. БелкиИспользуются различные реакции; в том числе:а) с бромфеноловым синим (у белков— тёмно-фиолетовая окраска); б) со смесью нингидрин-реактив Шиффа(белки приобретают красный цвет).
3а) ПолисахаридыШИК-реакция.1. Реактив — Шифф-периодная кислота (выделенные буквы и составляютаббревиатуру ШИК).2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, котораявзаимодействует с реактивом Шиффа.3. На препарате ШИК-положительные компоненты (например, гранулы гликогена)имеют тёмно-красный цвет.
Реакция с толуидиновым синим.1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими многокислотных групп, наблюдаетсяметахромазия— изменение окраски с синей на фиолетовую и красную.2. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты аморфного веществасоединительной ткани — гликозамингликаны(являющиеся, как известно, гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотныхрадикалов).
Реакция с суданом III (о которой уже упоминалось).Капли жира в жировой клетке окрашиваются вяркий оранжево-красный цвет благодаря растворению в них красителя.

3. Помывка в воде

После фиксации материал промывают (чаще всего  в течение нескольких часов в проточной воде) с тем, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих

жидкостей.

Изучить с помощью микроскопа такие фиксированные кусочки органов невозможно, т.к. они не прозрачны. Чтобы кусочек органа можно было микроскопировать, его надо разрезать на очень тонкие пластинки – срезы, толщина которых измеряется  в

микрометрах.

Такие срезы получают с помощью специальных приборов – микротомов. Но для того, чтобы резать на микротоме кусочек ткани, ее надо

предварительно уплотнить.

Это достигается путем  пропитывания застывающими жидкостями – расплавленным парафином. Парафин в воде не растворяется, и поэтому промытый после фиксации кусочек ткани необходимо предварительно обезводить,

 и только затем пропитывать.

5. Уплотнение (заливка)

При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для  парафина

(ксилол или толуол).

Заливка в парафин. При заливке в парафин кусочки из абсолютного спирта переносятся в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, взятых поровну, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при

температуре 37º  до 1 суток и более.

Дальнейшая  заливка проводится в термостате при температуре 54º -56º в трех порциях парафина. Окончательная заливка проводится в парафин с добавлением воска, который наливают в специальные бумажные коробочки или стеклянные чашки, а затем  эти коробочки или чашки после появления на поверхности

парафина пленки, погружают в воду.

Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные

кубики, получаются парафиновые блоки.

Уплотнения также можно добиться  замораживанием

кусочка органа (срочная биопсия). 

7. Окрашивание

Изготовленные на микротоме срезы окрашиваются. Перед окраской из парафиновых срезов обязательно

удаляют парафин (растворением в ксилоле).

Окрашивание необходимо производить для  того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах большинство структур одинаково преломляет свет, поэтому рассмотреть

их не удается.

Выявление на срезе гистологических структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Одни структуры среза вступают в реакцию с кислыми красителями и ими окрашиваются (ацидофильные, оксифильные структуры), другие реагируют с основными красителями и окрашиваются преимущественно ими (базофильные структуры). Некоторые структуры окрашиваются и кислыми и основными

красителями.

По происхождению различают краски естественные, к которым относятся краски растительного и животного происхождения, и краски искусственные. Краской растительного происхождения является гематоксилин, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке

и  в Армении.

К краскам животного происхождения относится кармин, который добывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях в Мексике, Армении

и др.

По окрашиванию определенных гистологических структур различают краски ядерные (окрашивание ядра), цитоплазматические (окрашивающие цитоплазму), и специальные, окрашивающие избирательно определенные

структуры.

Ядерные краски – гематоксилин, кармин, сафранин,

метиленовая синь, азур, тионин.

Цитоплазматические
краски – эозин, пикрофуксин.

Существуют специальные краски и реактивы: судан Ш (окрашивает жир в оранжевый цвет), осмиевая кислота (импрегнируемый ею жир окрашиватся в черный цвет), резорцинфуксин Вейгерта (дает темно-синюю окраску эластических волокон), орсеин (окрашивает эластические волокна в

бурый цвет).

Чаще всего для окрашивания гистологических срезов применяется окрашивание раствором гематоксилина (приготовленным по методу

Бемера) и 1-2% эозином.

8. Заключение среза

Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70º, 96º),  просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю бальзама  и срез накрывают покровным

стеклом.

Бальзам представляет собой растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны, растущей в Канаде (канадский бальзам),  смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую

среду.

При исследовании биопсий с целью уточнения диагноза в гистологических лабораториях прибегают к ускоренной обработке материала. Кусочки тканей и органов при этом проходят те же этапы обработки, но

за 5-7 дней.

Иногда производится так называемая срочная биопсия, когда в течение 15-80 мин. материал фиксирует, получают срезы, окрашивают их и заключают. Быструю фиксацию производят в 10% формалине, подогреваемом пламенем

горелки или с использованием СВЧ-печи.

Источник: https://kono-pizza.ru/tsitologiya/okraska-gematoksilin-eozinom-tsitologiya/

Методика окрашивание гематоксилином и эозином

Окраска гематоксилин эозином цитология

Окраска гематоксилином и эозином наиболее распространенный метод окрашивания срезов для обзорного изучения материала, так как дает возможность установить взаимоотношение структур тканей и их состояние, а также выявить патологические изменения.

Окраска гематоксилином и эозином является двойной: гематоксилин – основной краситель и окрашивает ядра в сине-фиолетовый цвет, эозин – кислый краситель и окрашивает цитоплазму в розовый цвет и в меньшей степени различные внеклеточные структуры. Гематоксилин представляет собой экстракт древесины кампешевого дерева, произрастающего в Америке. Эозин является искусственным красителем.

Внимание! Растворы красителей и  необходимая лабораторная посуда должны быть приготовлены для окраски заранее.

Перед окрашиванием парафиновых срезов необходима обработка с целью удаления парафина и пропитывания их той жидкостью, в которой растворена краска. Для удаления парафина применяют обычно ксилол несколько порций (2-3), а при отсутствии его можно использовать толуол или бензол.

Чаще применяют водные растворы красителей, поэтому в этом случае и срез должен быть пропитан водой. Необходимо помнить, что ксилол в воде не растворяется и поэтому сразу переносить срезы из ксилола в воду нельзя. Предварительно освободиться от ксилола возможно, обрабатывая срезы в спиртах.

Сначала проводят через абсолютный спирт, а затем в 96 и 70 градусных спиртах. Лишь после этого предметное стекло переносят в стаканчик с дистиллированной водой.

Для подготовки срезов для окраски необходимо иметь 8 биологических стаканчиков, 3 – для ксилола, 1 – для абсолютного спирта, 1 – для 96% спирта, 1 – для 70% спирта и 1 стаканчик для дистиллированной воды.

Схема депарафинирования срезов:

Реактивы Время (в минутах)
Ксилол – 3 порции       4-5
Абсолютный спирт 2-3
Спирт 96% 2-3
Спирт 70% 2-3
Дистиллированная вода 1-2

Переносить парафиновые срезы на предметном стекле из одного ста-канчика в другой надо осторожно, поддерживая ее, чтоб дать жидкости стечь с поверхности. Ускорить эту процедуру можно, прикладывая к реб-ру стекла фильтровальную бумагу под углом. Надо помнить, что срезы быстро подсыхают и поэтому все процедуры надо проводить осторожно и быстро.

Пропись окрашивания парафиновых срезов по методике гематоксилином и эозином

1. Депарафинизация срезов – проводится в ксилол-спирте, иногда применяется йодистый спирт или гипосульфит натрия (см. выше);

2. Дистиллированная вода;

3. Окрашивание ядер гематоксилином – в течение 2-5 минут;

4. Промывка в дистиллированной воде;

5. Промывка в водопроводной воде;

6. Контроль под микроскопом (при необходимости докрасить);

7. Дифференцировка 1% солянокислым спиртом в течении 1-2 секунды, затем срезы быстро переносят в водопроводную воду;

8. Промывка в дистиллированной воде при частой смене. Контроль под микроскопом, если ядерная структура выявляется не четко, то необходимо повторить дифференцировку;

9. Промывка в дистиллированной воде;

10. Окрашивание в 1% растворе эозина в течение 1-2 минут;

11. Промывка в дистиллированной воде с её дифференцировкой под контролем микроскопа (опытные лаборанты могут на глаз);

12. 96% спирт в течение 1-2 минут;

13. Абсолютный спирт (дважды) – по 2 минуты

или карбол-ксилол в течение 1-2 минут;

14. ксилол (дважды) – по 2 минуты;

15. Заключение микропрепарата канадским бальзамом;

16. Покрытие покровным стеклом (осторожно с угла края стекла опускают над срезом, чтоб не было пузырьков воздуха).

Необходимо знать: Для выяснения времени окраски гематоксилином или эозином надо предварительно определить на пробных срезах данного блока.

1) Если гематоксилин окрашивает срезы очень быстро даже при кратковременной обработке ядра, применяют метод с последующим её ослаблением до нормальной окраски.

С этой целью препарат заведомо перекрашивают и из воды срезы переносят на несколько секунд в слабый раствор соляной кислоты в 70% спирте (5-6 капель крепкой соляной кислоты на 100мл спирта). При этом усиливается красный оттенок.

В большинстве случаев достаточно опустить срез на 1-2 секунды в солянокислый спирт, чтобы получить желаемый тон. Далее по прописи. Данная пропись наиболее распространена при окраске гематоксилином Эрлиха.

2) Если эозин плохо окрашивает срезы, его можно подкислить уксусной кислотой (1 капля 3% уксусной кислоты на 100 мл раствора эозина). Следует иметь в виду, что в спиртах окраска срезов эозином несколько ослабляется, поэтому проводить срезы до карбол-ксилола следует быстро.

Источник: https://studopedia.net/10_40050_metodika-okrashivanie-gematoksilinom-i-eozinom.html

Гематоксилин — эозин

Окраска гематоксилин эозином цитология

ОКРАСКА ГЕМАТОКСИЛИНОМ — ЭОЗИНОМ

Окраска гематоксилин-эозином — наиболее распространённый метод окрашивания срезов. Этот методпозволяет установить отношения между частями органа, отлично выявляя все клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры.

Практически во всех случаях независимо от поставленной задачи применяется окраска гематоксилин-эозином. В большинстве случаев для изучения структуры нормального или измененного в результате болезни органа ограничиваются этим методом окраски.

В других случаях, когда перед исследователем стоит специальная задача, пользуются особыми методами, окрашивая в то же время параллельно ряд срезов гематоксилин-эозином.

Эта окраска является двойной: гематоксилин — основной краситель — окрашивает ядра клеток, эозин — кислый краситель — красит протоплазму клеток и в меньшей степени — различные неклеточные структуры.

Гематоксилин представляет собой экстракт древесины кампешевого дерева, произрастающего в Америке. Эозин — искусственная краска. Растворы красителей должны быть приготовлены заранее. Гематоксилин сам по себе не является красящим веществом.

Для того чтобы приготовить краску, гематоксилин подвергают окислению, в результате чего он превращается в красящее вещество — гематеин.

В соединении с некоторыми солями гематеин дает четкое окрашивание ядер (используют гематоксилин Эрлиха, Майера, железный гематоксилин Гейденгайна).

Эозин — протоплазматический краситель; используется он в виде спиртовых или, гораздо чаще, водных растворов. Для приготовления эозина 0,1 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Подготовка срезов к окраске заключается в их кратковременной обработке спиртом.

Поскольку при заливке в парафин или целлоидин материал обезвоживается в спиртах, срезы, полученные при этих способах заливки, в особой подготовке для окраски гематоксилин-эозином не нуждаются. Обрабатывать необходимо замороженные срезы. При этом происходит их обезжиривание и другие изменения в структуре, что значительно улучшает окрашивание гематоксилин-эозином.

Срезы обрабатывают в 96° спирте не более 3-5 минут. Из спирта срезы переносят обратно в дистиллированную воду. Окраску производят сначала гематоксилином.

Порядок проведения окраски:

Дистиллированная водаополоснуть
Раствор гематоксилина1-20 мин
Солянокислый спиртдифференцировка
Аммиачная водасрезы синеют (контроль под микроскопом)
Проточная вода5-10 мин
Дистиллированная водаополоснуть
Раствор эозина10с-3 мин
Спирт 96%, карбол-ксилол, заключение

Результат: ядра синие, цитоплазма и межклеточное вещество розовые.

Примеры практических микропрепаратов, окрашенных гематоксилином-эозином:

Рис. 1, 2. Болезнь Фара (феррокальциноз). В веществе головного мозга из зоны подкорковых ядер зональное обызвествление (практически без признаков склероза) стенок небольших сосудов (капилляров, мелких артерий и артериол) различной степени выраженности (от пылевидного включения солей кальция в толще стенки до полного замещения сосудистых стенок кальцинатами). Вдоль стенок большинства капилляров густо расположены небольшие округло-овальные кальцинаты по типу псаммом, вокруг отдельных капилляров образованы целые муфты петрификатов.Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х100 и х250.
Рис. 3, 4. Болезнь Фара (феррокальциноз, другое наблюдение). Крупные группы густо расположенных мелких сосудов с наличием циркулярного пылевидного и в виде мелких гранул кальциноза стенок, расположенного между адвентицией сосудов и средней их оболочкой, в толще средней оболочки, полностью замещающего сосудистую стенку. Видны фрагменты сосудистых стенок в косопоперечном, продольном срезе, утолщенные кальцифицированные стенки выглядят как «кусочки вермишели».Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.
Рис. 5. Очаговый интрамуральный кардиосклероз. Сохранившиеся кардиомиоциты в состоянии выраженной белковой зернистой дистрофии, выраженной гипертрофии.Окраска: гематоксилин-эозин.Увеличение х250.Рис. 6. Умеренная-выраженная гипертрофия кардиомиоцитов, белковая зернистая их дистрофия. В цитоплазме ряда кардиомиоцитов вокруг ядер расположены мелкие скопления золотисто-жёлтого «пигмента старения» липофусцина. Очаговая круглоклеточная инфильтрация стромы. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.
Рис. 7, 8. Грибковый перикардит (острый гнойно-фибринозный), группа гиалогифомикозов. Очаги выраженной лейкоцитарной инфильтрации с включениями относительно рыхлого фибрина на фоне очагово-диффузных диапедезно-деструктивных кровоизлияний расположены в эпикарде и субэпикардиальной жировой ткани. Здесь же расположены колонии грибковой микрофлоры, относящейся к гиалогифомикозам: хорошо окрашены гематоксилином-эозином, гифы в диаметре около 2-3 мкм, разрастаются пучками от центрального фокуса в виде «кустарника». Некоторые гифы дихотомично делятся. Мицелий септированный.Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 9, 10. Метастазы плоскоклеточного рака в миокард, субэпикардиальную жировую ткань. Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 11. Актиномикоз лёгкого с перифокальной картиной очаговой острой гнойной пневмонии.Окраска: гематоксилин и эозин.Увеличение х100.Рис. 12. Лёгочная миграция личинки аскариды. В просвете альвеолы червеобразная структура розового цвета, свёрнутая в клубок, с признаками её движения (тонкие перифокальные полоски просветления в реактивном гнойном экссудате).Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 13-15. Грибковая (кандидозная) пневмония. Лёгочная ткань разрушена за счёт выраженного разрастания древовидного мицелия с перифокальной острой гнойно-фибринозной пневмонией. В отдельных полях зрения видны спорангии со спорами.Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.Препараты предоставлены кафедрой судебной медицины Ижевской ГМА, Свердловским ОБСМЭ.
Рис. 16, 17. Грибковая (кандидозная) пневмония. Лёгочная ткань разрушена за счёт выраженного разрастания мицелия с большим количеством спороносцев.Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х100 и х250.
Рис. 18. Криптококкоз лёгкого.Окраска: гематоксилин и эозин.Увеличение х100.Рис. 19. Криптококкоз печени.Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 20, 21. Печень. Очаговое острое гнойное межуточное воспаление с преобладанием эозинофилов. Очаговое выраженное полнокровие синусоидных капилляров и центральных вен с эритростазами, диапедезными микрогеморрагиями. Гепатоциты в состоянии выраженной белковой зернистой дистрофии, мелко — и крупнокапельной жировой дистрофии. Часть печёночных клеток в состоянии некробиоза-некроза.Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.
Рис. 22. Выраженная очаговая гидропическая дистрофия гепатоцитов, сочетающаяся с мелко — и крупнокапельной жировой дистрофией печёночных клеток. Окраска: гематоксилин-эозин.Увеличение х250.Рис. 23. Гигантоклеточный гепатит. Неравномерное полнокровие синусоидных капилляров. Белковая зернистая дистрофия, признаки неравномерно выраженной их регенерации в виде деления ядер и самих клеток. Диффузно в срезах в большом количестве расположены гигантские многоядерные макрофаги.Окраска: гематоксилин-эозин.Увеличение х250.Препараты предоставлены кафедрой судебной медицины Ижевской ГМА
Рис. 24, 25. Выраженный очагово-диффузный гемосидероз ткани печени. Большое количество клеток Купфера с цитоплазмой, нагруженной большим количеством буро-коричневого пигмента. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.
Рис. 26-29. Почка с резко выраженной белковой зернистой дистрофией, гидропической (вплоть до баллонной) дистрофией эпителия канальцев, с некробиозом-некрозом отдельных эпителиоцитов и групп клеток различной величины, атрофией ряда канальцев различной степени выраженности. Наличие в просветах части канальцев свежих ярко-красных эритроцитов (гематурия) и выщелоченных эритроцитов, гиалиновых цилиндров, слущенных эпителиоцитов.Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 30, 31. Выраженный очагово-диффузный гемосидероз селезёнки.Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 32, 33. Светлоклеточный рак почки.Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.Препарат представлен экспертом Ким С.В..

Источник: https://practicagystologa.ru/2016/04/30/gematoksilin-eozin/

Окрашивание срезов гематоксилин-эозином

Окраска гематоксилин эозином цитология

1. Депарафинировать в ксилоле – 2 мин.

2. Удалить ксилол 96° спиртом – 2 мин. Затем стекло со срезами поместить в дистиллированную воду – 2 мин (можно дольше).

3. Окрашивание: на срез нанести каплю раствора гематоксилина на 2-З мин.

4. Срез поместить в водопроводную воду на 5- 10 мин (можно на сутки, тогда гематоксилин лучше “вызреет” и окраска будет лучше).

5. Срез ополоснуть дистиллированной водой и нанести каплю раствора эозина – 1 мин.

6. Сполоснуть в 2-3 порциях дистиллированной воды по 0,5-1 мин в каждой.

7. Обезводить в двух порциях 96° спирта по 1 мин в каждом (лучше капать из капельницы).

8. Окончательно обезводить в 100° спирте или карбол-ксилоле – 1 мин.

9. Просветлить срез ксилолом – 2 мин.

10.Заключить срез в бальзам и покрыть покровным стеклом.

После этого препарат подсушивают, чтобы бальзам затвердел. Хранят препараты в защищенном от света месте.

Методика окрашивания гематоксилином
и эозином целлоидиновых срезов

1. Окрасить в гематоксилине в течение 2-3 мин.

2. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде по 2-5 мин.

3. Окрасить в эозине в течение 1-2 мин.

4. Промыть в дистиллированной воде в течение 0,5-1 мин.

5. Обезводить в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %) по 1-2 мин.

6. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилоле по 2-3 мин.

7. Заключить окрашенные срезы в бальзам.

Окрашивание срезов для обзорных целей

Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т.д.). Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей. Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем – цитоплазма.

Ядерные (основные) красители.Для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.

Гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности.

Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет.

Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином (см. ниже).

Железный гематоксилин Гейденгайна окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. Для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 недель.

Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2-12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кри­сталлы квасцов только фиолетового цвета.

После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1-36 ч раство­ром гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя.

Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.

Железный гематоксилин Вейгерта готовят в виде двух основных растворов – раствора Вейгерта I и раствора Вейгерта II. Раствор Вейгерта I представляет собой 1% раствор

гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта II имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды.

Официнальный раствор полуторахлористого железа – это 50% раствор водного хлорного железа (FеСl3, 6Н20). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин.

Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором хлористоводородной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет.

Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.

Квасцовый карминприготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина.

Время окрашивания – 0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет.

Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.

Сафранин является прекрасным ядерным красителем, осо­бенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды.

Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте.

Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.

Кислые красители.Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для докрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина.

Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты).

Время окра­шивания 2-5 мин. Цитоплазма клеток и эритроциты красятся в желтый цвет.

Методика окрашивания срезов гематокси­лин-эозином. Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-30 мин или на ночь в 96% спирт.

Далее срезы переносят в дистиллиро­ванную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депа­рафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повтор­ного использования.

Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следу­ющий: 1) срезы переносят в дистиллированную воду;

2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;

3) промывают в дистиллирован­ной воде;

4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;

5) осуществляют контроль под микроскопом;

6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с;

7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;

8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);

9) промывают в дистиллированной воде;

10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;

11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;

12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спир­тах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро.

Время окрашивания в гематоксилине нужно устано­вить на первых 2-3 срезах и затем все срезы данного блока окраши­вать одинаково.

Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими, и в цитоплазме может быть синеватый фон.

Методика окрашивания азур-2-эозином. Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессив­ный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина.

Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 100-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интен­сивно окрасились срезы.

Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в кси­лоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом.

Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.

В качестве обзорной окраски можно рекомендовать также железный гематоксилин-пикрофуксин по Ван-Гизону.

Методика окрашивания железным гематоксилин-пикрофуксином по Ван-Гизону. Срез окра­шивают железным гематоксилином Вейгерта в течение 2-5 мин. Вместо гематоксилина Вейгерта можно использовать гематоксилин Эрлиха. Дифференцировки не требуется, так как срезы дифферен­цируются в пикрофуксине.

Для приготовления раствора пикрофуксина к 100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты добавляют 10 мл 1% водного раствора кислого фуксина. Раствор пикрофуксина хранится длительное время. После окрашивания железным гематоксилином срезы ополаскивают в дистиллирован­ной воде и переносят в пикрофуксин на 3-5 мин.

Затем промывают дистиллированной водой, обезвоживают в спиртах, начиная с 96%, проводят через ксилол и заключают в бальзам. В воде смывают фуксин. Если пропустить промывку в воде – обсушить срез филь­тровальной бумагой, что иногда делают, мышечная ткань может быть окрашена в розовый цвет, а не в желтый, как полагается.

Если промывать в воде слишком долго, фуксин смывается полностью. Пикриновая кислота смывается в спирте, поэтому обезвоживать нужно быстро.

В результате окрашивания ядра клеток должны быть темно-коричневыми (или темно-фиолетовыми при окрашива­нии гематоксилином Эрлиха), коллагеновые волокна – красными, мышечная ткань, цитоплазма различных клеток и эритроциты – желтыми.

Вопросы для самопроверки

  1. Определение гистологии как науки.
  2. Объекты исследования гистологии.
  3. Перечислите основные свойства микроскопического препарата.
  4. Назовите основные этапы изготовления гистологического препарата.
  5. Какие группы красителей используют в гистологической практике?
  6. Чем отличаются временные гистологические препараты от постоянных?
  7. Объясните принцип работы на микротоме?
  8. Техника приготовления тотальных препаратов.
  9. Какие методы исследования применяют в цитологии и гистологии?
  10. Типы микроскопов.
  11. Сходства и различия в световой и электронной микроскопии? Разрешающая способность и увеличение.
  12. Правила пользования и устройство светового биологического микроскопа.
  13. Правила оформления лабораторной работы.
  14. Техника приготовления гистологического препарата – окраска гематоксилин и эозином.
  15. Дайте характеристику и классификацию фиксаторам.
  16. Назовите наиболее употребительные фиксаторы.
  17. Назовите оптимальную толщину срезов при использовании заливки в парафин.
  18. Преимущества и недостатки четырёх способов уплотнения материала: заливка в парафин, заливка в целлоидин, заливка в желатину; замораживание.
  19. Для каких исследований применяют заливку в поливакс (карбовакс). Сущность этого метода.
  20. Различные методы окраски гистологических срезов.
  21. Методы окрашивания для обзорных целей.



Источник: https://infopedia.su/13x158.html

Консультация доктора
Добавить комментарий